实验4平板菌落计数法和 显微镜直接计数法 主讲教师:王英明 复旦大学生物科学国家级实验教学示范中心
实验4 平板菌落计数法和 显微镜直接计数法 复旦大学生物科学国家级实验教学示范中心 主讲教师：王英明
原理 9 o ①显微镜直接计数法 计微生」②平板菌落计数法 物数③滤膜菌落计数法十间接计数法/菌计数法 微生物 ④MPN法 数量测定 ①重量法(干重或湿重) 测微生②光吸收法(A60m) 物量 ③成分测量法(如核酸法、叶绿素A法等) ④生理指标法(如测定呼吸强度、耗氧量和酶活等)
原理 微生物 数量测定 测微生 物量 计微生 物数 ① 显微镜直接计数法 ② 平板菌落计数法 ③ 滤膜菌落计数法 ④ MPN法 间接计数法/活菌计数法 ① 重量法（干重或湿重） ② 光吸收法（A600nm） ③ 成分测量法（如核酸法、叶绿素A法等） ④ 生理指标法（如测定呼吸强度、耗氧量和酶活等）
月 原理 平板菌落计数法在无菌培养皿中加适量菌悬液(或其稀释液),再加入融化并冷 却至适当温度(一般约50°℃)的固体培养基,混合均匀,平放至彻底凝固,然后适温培 养,其中的单个细胞(或单个孢子)形成一个菌落(也可能几个临近细胞形成一个菌 落)。根据适当稀释度平板上的菌落数,计算单位体积原始样品中的活菌数,即能够形 成菌落的微生物数(单位CFU, Colony- Forming Units)。 本实验采用平板菌落计数法测定环境水样中细菌菌落总数。细菌菌落总数是判定水样 污染程度的标志之一,按照GB5749-2006,我国生活饮用水的活菌数小于100CFU/mL。 测定细菌总数时,一般采用十倍稀释法稀释样品
在无菌培养皿中加适量菌悬液（或其稀释液），再加入融化并冷 却至适当温度（一般约50 ℃）的固体培养基，混合均匀，平放至彻底凝固，然后适温培 养，其中的单个细胞（或单个孢子）形成一个菌落（也可能几个临近细胞形成一个菌 落）。根据适当稀释度平板上的菌落数，计算单位体积原始样品中的活菌数，即能够形 成菌落的微生物数（单位CFU，Colony-Forming Units）。 本实验采用平板菌落计数法测定环境水样中细菌菌落总数。细菌菌落总数是判定水样 污染程度的标志之一，按照GB5749-2006，我国生活饮用水的活菌数小于100 CFU/mL。 测定细菌总数时，一般采用十倍稀释法稀释样品。 原理 平板菌落计数法
月 材料和仪器 1.样品:地衣芽孢杆菌,0.25g制成2500mL菌悬液 2.培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基。 3.仪器:培养箱、灭菌锅和恒温水浴锅。 4.其他材料和器皿等:煤气灯、生理盐水、无菌样品瓶、培养皿、无菌试管、移液管、 手动移液器、样品瓶(玻璃塞)
1．样品：地衣芽孢杆菌，0.25 g制成2500 mL菌悬液。 2．培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基。 3．仪器：培养箱、灭菌锅和恒温水浴锅。 4．其他材料和器皿等：煤气灯、生理盐水、无菌样品瓶、培养皿、无菌试管、移液管、 手动移液器、样品瓶（玻璃塞）。 材料和仪器
月 流程 0.5mL0.5m0.5mL0.5mh 原液 10 10 10 10-4 无菌生理盐水 4.5mL1.0mL 0mL\1.0m\1.0m ×2 ×2 1 融化并冷却 至50℃培 37°C 养基15n2 计数 培养48h 10-3 10-4 空白对照
10-2 10-3 10-4 空白对照 4.5 mL 1.0 mL 融化并冷却 至50 ℃培 养基15 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL ×2 ×2 ×2 ×1 原液 10-1 10-2 10-3 10-4 ×2 ×2 ×2 ×1 无菌生理盐水 流程 计数 37 ℃ 培养48 h
月 步骤 1.制备菌悬液 2.融化培养基和标记培养皿:牛肉膏蛋白胨固体培养基在105%C融化10min,50℃保温 备用。取7块无菌培养皿,用记号笔在皿盖上标记,102、10-3、104各2块,空白1块。 3.水样稀释:取3支无菌试管,依次编号为10-2、103、10-4,并在每支试管中加入4.5 mL无菌生理盐水。用1支1mL无菌移液管取0.5m原液,加入到10-试管中,摇匀。注 意,加样时移液管尖端不能接触试管中液体。另取1支1mL无菌移液管从1σ-试管中吸0.5 m水样至102试管中,混匀,继续稀释至104
1．制备菌悬液 2．融化培养基和标记培养皿：牛肉膏蛋白胨固体培养基在105 ℃融化10 min，50 ℃保温 备用。取7块无菌培养皿，用记号笔在皿盖上标记，10-2、10-3、10-4各2块，空白1块。 3．水样稀释：取3支无菌试管，依次编号为10-2、10-3、10-4， 并在每支试管中加入4.5 mL无菌生理盐水。 用1支1 mL无菌移液管取0.5 mL原液，加入到10-1试管中，摇匀。注 意，加样时移液管尖端不能接触试管中液体。另取1支1 mL无菌移液管从10-1试管中吸0.5 mL水样至10-2试管中，混匀，继续稀释至10-4。 步骤
月 步骤 4.加样和混合平板:取104试管中稀释样品1mL,加入相应标记的无菌培养皿中,马上 加入约15mL50℃保温的牛肉膏蛋白胨固体培养基,快速摇匀,注意动作要轻柔,以免 培养基从培养皿中摇岀。平板混好后,马上平放台面至彻底凝固。 继续加其他平板和空白对照平板,混合平板。 5.培养:凝固彻底的测定平板倒置于37℃C培养24h。 6.计菌落数:将平板取出,观察并计各个平板的菌落数。注意不同位置菌落形态的差异。 7.后处理:样品和培养物用沸水煮沸消毒,清洗
4．加样和混合平板：取10-4试管中稀释样品1 mL，加入相应标记的无菌培养皿中，马上 加入约15 mL 50 ℃保温的牛肉膏蛋白胨固体培养基，快速摇匀，注意动作要轻柔，以免 培养基从培养皿中摇出。平板混好后，马上平放台面至彻底凝固。 继续加其他平板和空白对照平板，混合平板。 5．培养：凝固彻底的测定平板倒置于37 ℃培养24 h。 6．计菌落数：将平板取出，观察并计各个平板的菌落数。注意不同位置菌落形态的差异。 7．后处理：样品和培养物用沸水煮沸消毒，清洗。 步骤
月 结果 1.计各个平板菌落数 103 10 空白 平均值 *表面的菌落同划线菌落,内部菌落针尖状,培养基和玻璃间菌落薄雾状。 *大于500,记作“多不可计” *平板菌落连成片状或链状少于面积一半,按另外一半平板计菌落数
结果 *表面的菌落同划线菌落，内部菌落针尖状，培养基和玻璃间菌落薄雾状。 *大于500，记作“多不可计”。 *平板菌落连成片状或链状少于面积一半，按另外一半平板计菌落数。 10-2 10-3 10-4 空白 1 2 平均值 1．计各个平板菌落数
月 结果 2.水样的细菌总数为 CFU/mL。 例不同稀释度的平均菌落数 稀释度 结果(菌落总「备注 101 102103菌落数之比数,CFU/mL) 1365 164 16X104(或16400) 1234 2760 4616(460/295)<238X104(或37750)两位以 后的数 2890 271 2.2 274104(或27100)字采取 150 15×103(或1500)四舍五 5多不可计1650513 51x105(或51300)入法取 27X102(或270) 7多不可计305 31x104(或30500)
例 不同稀释度的平均菌落数 稀释度 菌落数之比 结果（菌落总 数，CFU/mL） 备注 10-1 10-2 10-3 两位以 后的数 字采取 四舍五 入法取 舍 1 1 365 164 20 — 1.6 ˣ 104 （或16 400） 2 2 760 295 46 1.6(460/295)＜2 3.8 ˣ 104 （或37 750） 3 2 890 271 60 2.2 2.7 ˣ 104 （或27 100） 4 150 30 8 2 1.5 ˣ 103 （或1 500） 5 多不可计 1 650 513 — 5.1 ˣ 105 （或51 300） 6 27 11 5 — 2.7 ˣ 102 （或270） 7 多不可计 305 12 — 3.1 ˣ 104 （或30 500） 结果 2．水样的细菌总数为 CFU/mL
月 注意事项 1.采样时样品不要装满样品瓶,样品采集后应尽快测定。 2.用移液管取样品前必须混合均匀,移液管也需要润湿。 3.加入样品液后,马上加入融化并冷却至50℃固体培养基15mL,轻轻晃动混匀,平 放台面,彻底凝固后放入培养箱中培养。 4.实验应严格按照无菌操作进行。 5.计数时,根据各个梯度的菌落数,给出最后结果
注意事项 1．采样时样品不要装满样品瓶，样品采集后应尽快测定。 2．用移液管取样品前必须混合均匀，移液管也需要润湿。 3．加入样品液后，马上加入融化并冷却至50 ℃固体培养基15 mL，轻轻晃动混匀，平 放台面，彻底凝固后放入培养箱中培养。 4．实验应严格按照无菌操作进行。 5．计数时，根据各个梯度的菌落数，给出最后结果