血清谷丙转氨酶活性 的测定（King法）
■【目的要求】 ■1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 ■2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 ■3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义
【原理】 ■生物机体内转氨基作用是ā-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到 α一酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应， 催化这反应的酶称为转氨酶(transaminase),其辅酶为磷酸 吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾 等组织中的谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT),谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, G0T)活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水 平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变 时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从 而引起血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(G0T)活性显著 升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要 的参考价值
■血清中的谷-丙转氨酶(ALT),在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸： COOH COOH CHs C-H ALT -0 COOH 0-0 37℃、pH7.4 H2N -c-H COOH COOH L-丙氨酸 a酮戊二酸 a丙酮酸 L-谷氨酸
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸2,4二硝基苯腙，进而在碱性环境 中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关 系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或 通过标准曲线查出血清中ALT的活性。 NO2 NO2 GH3 H +H2N一N NO2- -NO2 doOH G-N- H-O COOH α-酮酸 2,4二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腺（黄色） OH NO2 -H0 GH3 G=N-N= >=N一O 茶踪销酿化合物红棕色)
COOH COOH C-H ALT H ★ -0 H COOH 0-0 37℃、pH7.4 COOH HaN-C-H COOH COOH L-丙氨酸 a酮戊二酸 a丙酮酸 L-谷氨酸 -0 HaN-N- GH3 H -NO2 o COOH a-酮酸 2,4二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯棕（黄色） NO H C-N-N- 销化合物红棕色
King氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血 清在37℃与pH7.4的基质液作用60min,生 成1umol丙酮酸为一个单位。临床检验取 血清量为0.1mL,报告数据以100mL血清 计算，因此实际测得结果乘1000即可。例 如0.1mL丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2umol,即相当GPT200U/100mL
试剂与器材 ■1、样品 动物或人血清 ■2试剂 1)甲液(1/15mol/L磷酸氢二钠溶液) 称取磷酸氢二钠(Na2HP04,A.R.)9.47g或含水磷酸氢二 钠(Na2HP04·12H20,A.R.)23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 2)乙液(1/15mo1/L磷酸二氢钾溶液) 称取磷酸二氢钾(KH2P04,A.R.)9.078g溶于蒸馏水中定容 至1000mL。 取甲液825mL,乙液175mL混合，此液PH应为7.4。 3)GPT基质液 称取a一酮戊二酸29.2mg(2mmol/L)及a-DL-丙氨酸 1.78g(200mmo1儿)溶于50mL,pH.4的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L Na0H溶液约0,5L,调节pH为7,4，然后加磷酸缓 冲液定容至100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存
■4)2,4-二硝基苯肼(1mmol/L) 称2,4一二硝基苯肼20mg。先溶于10mL浓盐 酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 ■5)丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠22mg。加磷酸缓冲液溶解后 定容至100mL。此溶液浓度为2μmol/mL,临用前 配制。0.4mo1/LNa0H溶液，1/15mol/L磷酸 缓冲液(pH7.4)。 ■3、器材 试管及试管架，移液管(0.5mL,1mL,5mL), 量筒(10mL,100mL),恒温水浴，722型分光 光度计，坐标纸
实验内容和步骤 ■1)制备标准曲线 、试管 测 定 管 试剂 、编号 空白管 3 处理 内刚酸标准液mL 0.05 0.10 0.15 0.20 基质液/ml 0.50 0.45 0.40 033 0.30 磷酸缓冲溶液mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 各管摇匀后，置37℃水浴，保温10min 24一二硝基苯册mL0.500.50 0.50 0.50 0.50 各管摇匀后.置37℃水浴，保温20min 0.4mol/L.NaOH/mL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分摇匀后，在30min内，520m波长下比色 相当丙酸实际含量 0.10 0.20 030 0.40 mol 相当GT单位/100mL 100 200 300 400 2北