实验二细菌的染色和 细菌细胞构造的观察 目的要求 染色剂和染色的原理 实验材料 实验程序 思考题
实 验 二 细菌的染色和 细菌细胞构造的观察 • 目的要求 • 染色剂和染色的原理 • 实验材料 • 实验程序 • 思考题
目的要求 学习微生物涂片 掌握细菌的一般染色法和革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造
目 的 要 求 • 学习微生物涂片 • 掌握细菌的一般染色法 和革兰氏染色 • 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 • 观察和识别细菌细胞的特殊构造
染色剂和染色原理 微生物染色的基本原理:是借助物理和化学因素的作用而进行 的。物理因素如:细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸 附作用等。化学因素如:正负离子之间的相互吸引等。 染色剂:染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型: 1.酸性染料:如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2.碱性染料:一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶 紫、美兰、甲基紫等,细菌易被碱性染料染色。 3.中性(复合)染料:如伊红、美兰等,Wh染料和 Gimsa 染料等(常用于细胞核染色)。 4.单纯染色:这类染料的化学亲和力低,大多是偶氮化合物, 不溶于水,但溶于脂肪溶剂中,如苏丹类( Sudan b)的染料
染色剂和染色原理 微生物染色的基本原理: 是借助物理和化学因素的作用而进行 的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸 附作用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。 染色剂: 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶 紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa 染料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物， 不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料
染色剂和染色原理: 微生物染色常用染料 称 性质发色基助色基 用途 结晶紫(龙胆紫) Crystal violet) 碱性对位醌一NH革兰氏染色等 番红(沙黄)( Safranin) 碱性双偶氮|一NH2革兰氏染色核染色 碱性复红(品红)( Dasic inchsin) 碱性对位醒一NH4核染色鉴别结核杆菌 美兰( Methyl blue) 碱性对位酸一NH2活体染色、放线菌染色氧化还原指示剂 刚果红( Congo red) 酸性双偶氮-NH2细菌负染色酵母菌染色 孔雀绿( Malachite green) 碱性对位醒一NH2细菌芽孢染色 苦味酸( Picric acid 酸性一NO2-OH染真菌细胞群海藻细胞壁 伊红(曙红y)( Eosin y) 酸性对位OH细胞质染色细胞的酸性颗粒染色 藻红(兰光赤星)( Erythrosin) 酸性对位酿一OH染土壤细菌 酸性复红(品红)( Acid fuchsin) 酸性对位醌一NH2单染色等 中性红( Neutral red) 碱性酿环|-NH2活体染色指示培养基鉴别肠道细菌等 亮绿(大皇绿)( Brilliant green) 碱性对位|一NH2细菌螺旋体等的染色,鉴别培养 苏丹I(三号苏丹红)( Sudan1) 酸性双侧氮一OH脂肪染色 荧光素( Fluorescein) 酸性羰基-OH菱光染色 黑素(水溶黑素)( nigrosin) 混合物 负染色用
染色剂和染色原理: 微生物染色常用染料
实验材料 涂片染色用的细菌培养物 1大肠杆菌( Escherichia coli24h的斜面培养物。 2枯草杆菌( Bacillus subtilis)12-16h的斜面培养物。 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火 柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 示范片 1.枯草杆菌( Bacillus subtilis)的芽孢; 2,胶质芽孢杆菌(Bac" us mucilaginosus)的荚膜; 3.草芽孢杆菌的鞭毛
实验材料 • 涂片染色用的细菌培养物 １.大肠杆菌（Escherichia coli) 24h的斜面培养物。 ２.枯草杆菌（Bacillus subtilis) 12—16h的斜面培养物。 • 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火 柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。 • 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 • 示范片 １.枯草杆菌（Bacillus subtilis)的芽孢； ２.胶质芽孢杆菌（Bacillus mucillaginosus）的荚膜； ３.枯草芽孢杆菌的鞭毛
实验程序 (细菌染色的方法和步骤) 细菌染色的方法 1单染色法:用一种染色液染菌体后,就可以观察 微生物的大小、形状、和细胞排列状况,但不能鉴 别微生物以及它的特殊构造等。 2复染色法:用两种或两种以上染色液进行染色, 有协助鉴别微生物的作用,故也称鉴别染色法。常 用的有:革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色 法、芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。 染色技术的般过程 凃片→干燥_→固定→染色—→媒染→脱色一→复染 水洗干燥镜检
实验程序: （细菌染色的方法和步骤） • 细菌染色的方法: • １. 单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察 微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴 别微生物以及它的特殊构造等。 ２. 复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色， 有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常 用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色 法、芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。 • 染色技术的一般过程 涂片 干燥 固定 染色 媒染 脱色 复染 水洗 干燥 镜检
实验程序 (简单染色的方法和步骤) 简单染色法(一般染色法) 1.,菌种:细菌培养物 2涂片 3.千燥:自然气干或酒精灯 高处微微加热。 4固定 5染色:在整个涂面上滴加 齐氏石炭酸复红,染色1分 钟 6水洗:倾去染液,用自来 水细流冲洗至流下的水中无染 料颜色为止。 7干燥:空气中自然干燥。8飞 镜检:在油镜下观察牙垢中的 图2-1涂片无菌过糕操作 各种细菌形态并绘图
实验程序: （简单染色的方法和步骤） 简单染色法（一般染色法） １.菌种：细菌培养物 ２.涂片 ３.干燥：自然气干或酒精灯 高处微微加热。 ４ 固定 ５.染色：在整个涂面上滴加 齐氏石炭酸复红，染色１分 钟 。 ６.水洗：倾去染液，用自来 水细流冲洗至流下的水中无染 料颜色为止。 ７干燥：空气中自然干燥。８ 镜检：在油镜下观察牙垢中的 各种细菌形态并绘图
实验程序: (革兰氏染色的方法和步骤) 革兰氏(Gram)染色法 1.涂片 2初染:在做好的涂面上滴加草 酸铵结晶紫染液,染1分钟,倾 去染液,流水冲洗至无紫色。 用结晶紫染色用自来水神洗用碘液媒染 3.媒染:先用新配的路哥氏碘液 冲去残水,而后用其覆盖涂面1 分钟,后水洗。 4脱色:除去残水后,滴加95%用来用少已用自来木 酒精进行脱色约30秒,后立即用 流水冲洗。 5.复染:滴加番红染色液,染1 分钟,水洗后用吸水纸吸干。 用番红复染「用自来水冲洗 吸干水分 6.镜检:观察染色结果并绘图。 图2-2革兰氏染色过程
实验程序： （革兰氏染色的方法和步骤） 革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草 酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾 去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液 冲去残水，而后用其覆盖涂面1 分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95% 酒精进行脱色约30秒，后立即用 流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1 分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图
实验程序: (荚膜染色的方法和步骤) 荚膜染色法(示范): 荚膜薄,易变形,因此在涂片过程中不能 用加热固定。 1.取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂 片,自然干燥,自然固定。 2染色:在已自然晾干的涂面上,滴加1% 结晶紫染色液染色2min,以20%硫酸铜冲 洗数次,再用自来水冲洗1次,晾干。 3.镜检:油镜观察示范片并绘图(菌体红 色,荚膜无色)
实验程序： （荚膜染色的方法和步骤） 荚膜染色法（示范）： 荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能 用加热固定。 1. 取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂 片，自然干燥，自然固定。 2. 染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1% 结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸铜冲 洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。 3. 镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体红 色，荚膜无色）
实验程序 (鞭毛染色的方法和步骤) 菌液的制备及涂片:菌种应预先连续传代5-6代。 1.接种:先在斜面底部加入05-1mL无菌水,取活化的枯草 杆菌1-2环菌苔,接种于无菌水中,30培养15-18h。 2.制备菌液:挑取斜面底部近水面处菌苔数环,移入1mL与 菌种同温的无菌水中,在280温箱中保温10min 3.鞭毛涂片:先用悬滴法观察其运动性,若运动性很强,即 可涂片。涂片后自然干燥、固定。 染色:染色液必须新配制,涂片必须充分晾干才能染色。 1.先用刚过滤的鞭毛染色液A染758min左右。 2.倾去A液,再加鞭毛染色液B液染3--5min,水洗,自然干 燥。 3.用C液石炭酸复红复染2min,水洗、晾干、镜检。 油镜下观察鞭毛的数目及着生情况(示范镜)并绘图 (菌体与鞭毛都呈红色,周生鞭毛)
实验程序 （鞭毛染色的方法和步骤） • 菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代5—6代。 1. 接种：先在斜面底部加入0.5—1mL无菌水，取活化的枯草 杆菌1—2环菌苔，接种于无菌水中，300C 培养15—18h。 2. 制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与 菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温10min。 3. 鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即 可涂片。涂片后自然干燥、固定。 • 染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。 1. 先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.5—8min左右。 2. 倾去A液，再加鞭毛染色液B液染3—5min，水洗，自然干 燥。 ３.用Ｃ液石炭酸复红复染２min，水洗、晾干、镜检。 • 油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图 （菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）