血清丙氨酸氨基转移酶活性测定
一 实验目的丫翠二实验原理三实验材料与仪器四实验步骤五注意事项六思考问题
一 实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器 四 实验步骤 五 注意事项 六 思考问题
实验目的一：学习穆氏法测定血清ALT活性的基本原理及方法。熟悉血清ALT活性测定的临床意义
学习穆氏法测定血清ALT活性的基 本原理及方法。 熟悉血清ALT活性测定的临床意义。 一 实验目的
实验原理二酶的活性通常都是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），特定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物生成量来确定的。转氨酶催化转氨基反应。转氨酶种类很多，ALT与AST与医学关系密切
二 实验原理 酶的活性通常都是在一定条件下（最适温 度、最适的pH、必要的激动剂等），特定的 时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物 的消耗量或产物生成量来确定的。 转氨酶催化转氨基反应。转氨酶种类很多， ALT与AST与医学关系密切
COOHCOOHMCH2CH2CH3CH3ALT-CH2CH2HC-NH2+-HC-NH2COOHCOOHCOOHCOOH丙酮酸谷氨酸丙氨酸α一酮皮戊二酸NO2NO2（碱性条件）CH3CH3HCN-NNNO2+H20NO20+H2N-COOHCOOH（红棕色）丙酮酸2，4-二硝基苯腺丙酮酸2，4-二硝基苯肼丙酮酸2，4-二硝基苯颜色深浅与丙酮酸量呈正比。因此利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，可测定出血清样品中ALT活性
（红棕色） （碱性条件） 丙酮酸2，4-二硝基苯腙颜色深浅与丙酮酸量 呈正比。因此利用比色分析原理将样品显色与丙酮 酸标准品配制成的系列标准液比较，可测定出血清 样品中ALT活性
三实验步骤1标准曲线的制作（表1）（表2）2血清ALT酶活性的测定3血清ALT活性计算本方法规定血清在37℃、pH为7.4时与ALT底物液作用30min，每生成2.5μg丙酮酸所需的(U)酶量为1个酶活性单位根据实验结果计算每升血清中ALT活性。换算出的丙酮酸ug数1000ALT活性（U/L血清）0.12.5
三 实验步骤 1 标准曲线的制作(表1） 2 血清ALT酶活性的测定（表2） 3 血清ALT活性计算 本方法规定血清在37℃、pH为7.4时与ALT底 物液作用30 min，每生成2.5 μg丙酮酸所需的 酶量为1个酶活性单位（U）。 根据实验结果计算每升血清中ALT活性
表1丙酮酸标准曲线的制作试管编号试剂2356412mmol/L丙酮酸标准液/ml0.050.100.150.200.25丙氨酸氨基转移酶底物液/m0. 500.450.400.350.300.250.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）/ml0.100.100.100.100.100.10各管混匀后，置于37C水浴中预温5mine0.50.50.50.50.50.52，4-二硝基苯肼溶液/ml各管混匀后，置于37°C水浴中保温20mine5.05.05.05.05.05.00.4 mol/LNaOH溶液/ml充分混匀。10min后，30min内在520nm处比色横坐标以蒸留水调零，读取各管吸光度值。丙酮酸的实际含量（μmol)00.50.10.20.30.4各管吸光度值A各管吸光度值减去空自管（第一管）吸光度值的差值纵坐标4←Back
表1 丙酮酸标准曲线的制作 横坐标 纵坐标
(ALT)活性的测定表2血清丙氨酸氨基转移酶试管编号试剂测定管对照管0.5丙氨酸氨基转移酶底物液0.5/ml置于37°C水浴中预温5min0.1血清/ml各管混匀后，置于37°C水浴中准确保温30min0.52，4二硝基苯膦溶液/m0.5血清/ml0.1各管混匀后，置于37C水浴中保温20min5.05.00.4moI/LNaOH溶液/ml充分混匀。10min后，30min内在520rm处比色。读取各管吸光度值各管吸光度值A用测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值平均数，从标准曲线查出相应的丙酮酸含量（uμmol），并换算为生成丙酮酸的微克数+Back
表2 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定 用测定管吸光度值减去对照管吸光度值的差值平均数，从标准曲线 查出相应的丙酮酸含量（μmol），并换算为生成丙酮酸的微克数
四注意事项采取相应措施以减少α一酮戊二酸对实验的干扰配置底物时用L一丙氨基酸如果血清中ALT酶活性过高，可以适当稀释后再进行测定血细胞中也含有ALT.故溶血标本不宜使用酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应严重控制温度和注意掌握时间本方法检测出的正常人每升血清中ALT活性<4方U
四 注意事项 采取相应措施以减少α-酮戊二酸对实验的干扰 配置底物时用L-丙氨基酸 如果血清中ALT酶活性过高，可以适当稀释后再进 行测定 血细胞中也含有ALT，故溶血标本不宜使用 酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应 严重控制温度和注意掌握时间 本方法检测出的正常人每升血清中ALT活性<4万U