级美 第六章 分子生物学基本研究法 (下)基因功能研究技术 nlPE& PgE
第六章 分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术
级美 6.1基因表达研究技术 6.1.1基因表达系列分析技术( Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的技术。任何长度超过910个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物,因此,根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率。 nlpe& PgE
6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（ Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物，因此，根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率
cDNA双链 AAAAA TTTTT·一生物素 AAAA TTTTTo 镭定酶AE酶切后,与抗生物素蛋白包裹 的微磁珠相连,分离3端酶切片段 AAAAA GTAC TTTT AAAAA GTAC TTTTT 图6-1常规SAGE方法 分两份,分别 与接头相连 ( short saGe)基本 [连搂 ACATG- AAAAA TTTTTe CCCTGTAC TTTTT一 流程 标签酶TE酶切 识别位点 识别位点 接子 GGGACATGXXXXXXI GGGACATGOOOOOO CCCTGTACXXXXXXXXXX CCCTGTACOOOOOOOOOC 末端补平 连搂 GGGACATGXXXXXXXXXX GGGACATGOOOOOOOOOO CCCTGTACXXXXXXXXXX 连接子2 CCctgtacoooooooooo 连接并根据接头1、2设计引物 连接子 GGGACATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGTCCC CCCTGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACAGGG 连接子2 锚定酶酶切,分离纯化双 标签并串联入载体中 - CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG GATCEXXXXXXXXOOOOOOOOgGATCXXXXXXXXX80000ooooGATC AE TagI Tag3 Tag4 测序并用计算机辅助分析 nlPE& PgE
图6-1 常规SAGE方法 （short SAGE）基本 流程
级美 LongSAGE技术 标签来自转录物3端一段21bp的序列,可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与 ShortAGE方法类似,只是 用了不同的S类标签酶(Mme),并将程 序做了相应修改 nlPE& PgE
LongSAGE技术 标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程 序做了相应修改
级美 6.1.2RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为:平衡剪切、5选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相 互排斥性剪切。常用 RT-PCR法研究某个基 因是否存在选择性剪切。 nlPE& PgE
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相 互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在选择性剪切
级美 5′ss ass (b) ass 3ss 3ss 5's 3ss ass 3ss (d) ass 3ss 图6-2选择性剪切的不同类型UPE&PGE
图6-2 选择性剪切的不同类型
级美 ≡n 1239 75 1674 1458 792 765 ■■H■H 1173 1020 子H■■H■ 995 (d) 三s 1659 39 1000 2000 30003400bp) 图6-3RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切 nlPE& PgE
图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切
外显子4外显子6外显子9外显子1 基因组DNA 121 481 3312 图6-4果蝇( Drosophila melanogaster)的 Dscam基因可 以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体 nlpe& Pge
图6-4 果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可 以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体
级美 6.1.3原位杂交技术 原位杂交( n Situ Hybridization,lSH)是 用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射 检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段,分为RNA和染色体原位杂交两大类。 nlPE& PgE
6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为RNA和染色体原位杂交两大类
级美 RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高 辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子,两者杂交产生双链RNA,可 通过放射性标记或经酶促免疫显色,对该基 因的表达产物做出定性定量分析。 nlPE& PgE
RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析