课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第十五讲) 章节标题：第三节微生物特有的合成代谢途径 第四节微生物代谢的调节 目的要求：1.了解C02固定的四种途径 2.了解生物同氮作用的几种类型 3.掌握固氮酶的组成和活力测定的方法 4.了解微生物代谢调节的方式 教学重点：1.生物周氮作用的几种类型 2.固氮酶的组成和活力测定的方法 教学难点：固氨酶的组成和活力测定的方法 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： 1.C02固定的四种途径 20分钟 2.了解生物固氮作用的几种类型 25分钟 3.固氨酶的组成及微生物代谢调节的方式 50分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年4月16日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第三节微生物特有的合成代谢途径 在这一节里我们只介绍微生物特有的合成代谢类型。包括C02的固定、生物 固氮、肽聚糖的合成和次生代谢物的合成。 一、C02的固定 C02的同定作用是将空气中的C02同化为细胞物质的过程。自养微生物将生 物氧化中取得的能量主要用于C02的固定，在进一步合成糖、脂类和蛋白质等细 胞组分。已知自养微生物同定C02的途径有4条 (一)卡尔文循环 大多数细菌的光合作用和绿色植物一样，主要通过卡尔文循环周定二氧化 碳。主要分为3个阶段：二氧化碳的固定、被固定的二氧化碳的还原、接受二氧 化碳分子的再生。 细菌的光合作用和绿色植物有相似之处：都含有光合色素，以C02为碳源合 成有机物质，把光能转变成化学能贮藏起来。不同之处主要有： 光合色素不同，绿色植物是叶绿素，细菌是菌绿素和类胡萝卜素 光和磷酸化途径不同植物存在着环式和非环式光合磷酸化两条途径，而细菌 主要是环式光合磷酸化。 氢供体不同，光合产物也不同，植物光合作用中氢供体是水，有分子氧和还 原力产生：细菌的氢供体是硫化氢等无机物，没有氧放出不产生还原力，而是积 崇硫。 (二)厌氧乙酰辅酶A途径 产乙酸菌、产甲烷菌与某些硫酸盐还原细菌无卡尔文循环，因此利用厌氧乙 酰CoA固定C02。反映的关键酶是C0脱氢酶。固定时要有四氢叶酸和类咕啉等 辅酶的参与。每次固定2分子C02,产物为乙酸。 (三)还原性三羧酸循环途径 一些绿色细菌如：嗜硫代硫酸盐绿菌，每次循环固定3分子C02,需要还原 态铁氧还蛋白参加，产物为丙酮酸。 (四)羟基丙酸途径 少数绿色硫细菌特有的C02固定机制。2分子C02变为草酰乙酸，因为该反 应的关键步骤是羟基丙酸的产生而得名
二、生物周氮 氮气占空气体积的80%，但动物、植物和大多数微生物都不能直接利用它。 只有少数的某些微生物可以利用分子氮作为氮源。因此，我们把经微生物细胞内 酶系的作用将分子态氯转变成含氮化合物的过程叫微生物的固氮作用。推动这 过程的唯一生物类群就是原核微生物， 如果把光合作用看作是地球上最重要的生物化学反应的话，则生物固氮应当 是地球上仅次于光合作用的第二个最重要的生物化学反应。 (一)固氮微生物 具有固氮作用的微生物近五十个屈，包括细菌、放线菌和蓝细菌。目前尚未 发现真核微生物具有固氮作用。根据固氮微生物与高等植物以及其它生物的关 系，可以把它们分为三大类：自生周氮体系，共生周氮体系和联合周氮体系。 自生固氮菌 自生周氮微生物能独立进行固氯，在固氮醇的作用下将分子氮转化成氨，但 不释放到环境中，而是进一步合成氨基酸，组成自身蛋白质。只有当这种微生物 死亡后通过氨化作用才能被植物吸收，他的固氮效率很低 褐球固氨菌是最常见的自生固氨菌，幼龄细胞呈杆状，后变为圆形。细胞荚 膜比较发达，有时4个细胞连在一起产生非水溶性色素。在琼脂培养基上，菌落 有无色透明转为白色，然后转为褐色，一般在荣园的土中可以分离到。 共生固氮菌 这种微生物一般需要与高等植物共生才能固定分子氨，或者只有在共生条件 下才能表现旺盛的固氨作用。 与自生固氨菌相比，共生固氨菌具有更高的固氨效率。在所有的共生固氯菌 中，最重要的是与满江红共生的满江红鱼腥蓝细菌和与豆科植物共生的根瘤菌。 满江红是一种蕨类枯物。鱼腥蓝细菌生活在满江红同化叶片的共生腔里，稻 田养萍可以增加稻田产量就是利用满江红鱼腥蓝细菌的固氮作用。据计算，满江 红每公顷养殖面积每年满江红鱼腥蓝细菌可固氮313kg,与豆科植物共生的根瘤 菌每公顷每年大约能固定150-180kg氨素，并且能将所固定的氮约90%供植物利 用。所以农业上栽培豆科植物常作为养地的一项重要措施。 根瘤菌和豆科植物共生有一定的专一性，每种根瘤菌只能在一种或几种豆科
植物上形成根瘤。所以，种豆科植物施用根瘤肥料，应该选用相应的根瘤菌制剂。 根瘤的形成从根瘤菌侵入豆科植物的根毛开始，根瘤菌侵入根毛细胞并繁 殖。根毛分泌纤维质物质包围根瘤菌形成套装的侵入线。随着根瘤菌的繁殖，袋 装侵入线不断仲长，最后到达皮层深处，刺激皮层细胞分裂，使皮层加厚形成根 瘤。皮层细胞了的根瘤菌加速膨大、分裂形成类菌体。随者含根瘤菌的皮层细胞 的形成，细胞中产生豆血红蛋白，此时根瘤成熟并开始固氮。 联合固氨菌。 这是一类必须生活在植物根系、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物，如 产脂螺菌。他们既不同于典型的共生固氮微生物，不形成根瘤等结构：也不同于 自生固氮微生物，因为它们有较强的寄主专一性，并且固氮作用比在自身条件下 强得多。 (二)固氨的生化机制 1.同氮反应的必要条件包括：固氮酶、ATP的供应、还原力[H)及其传递载 体、还原底物一2、镁离子、严格的厌氧微环境。 ATP:由呼吸作用，发酵或光合磷酸化提供 还原力和其传递载体：固氨过程所需要的大量还原力[H]或电子由NAD(P)H2 所提供，它们由电子载体铁氧还蛋白(Fld,ferredoxin)或黄素氧还蛋白(F1d, flavodoxin)传递至固氯酶上 固氨酶 固氨酶：含有两种成分，固二氮酶（组分I)和固二氮酶还原酶（组分Ⅱ）， 组分【是真正的固氮酶，称钼铁蛋白，功能是络合、活化和还原2，组分Ⅱ又 称铁蛋白，实质是固二氮酶还原酶，功能是传递电子到组分1上。 此外还需要分子氨、镁离子和厌氧环境。 2.固氨酶活力的测定一乙炔还原法 固氮酶的专一性不完全：也就是说，它除了对氮的还原以外，它还催化乙块到 乙烯的还原，乙炔和乙烯这两种化合物都是气体的而又不是大气中的成份，因此 可以用气相色谱仪检测出来，从所测试的乙烯的数量就可以推算固氮量（根据还 原的乙炔其理论转化系数为0.3（还原的乙快/固定的N2)来计算所固定的2，） 固氨总反应式为
N2+6e+6H++12ATP-->2NH3+12ADP+12Pi 3.固氯的生化途径 生物周氮作用能提高土壤肥力。长期以来一直受到人们的重视。现在己经制 成的根瘤菌制剂、联合固氮菌剂等各种固氮菌剂用于农业生产，增产效果十分显 著。固氮菌由于其周氯酶的特性而对铁和钼敏感，在缺铁、缺钼的土壤中使用钼 肥、铁肥可以提高其固氮效果。 4,固氨酶的产氢反应 固氮酶同时还具有氢化酶的作用，可以将氢离子还原为氢气释放。但是，周 氮酶的两个组分对氧都十分敏感，遇到氧分子就会发生不可逆的失活，因此周氮 作用只能在厌氧条件下进行。可是大多数同氮微生物都是好氧菌，而且它们生物 周氯所需的大量能量都来自好氧呼吸，那么这不是和固氮作用的厌氧环境相矛盾 了吗？不必担心，既然固氮微生物能在进化过程中长期生存，就说明肯定它有它 的办法。这个办法就是在固氮过程中，固氮氯酶始终受防氧保护机制的保护。 (三)好氧固氨菌防止氧伤害其固氨酶的机制 1、好氧性自生固氮菌的抗氧保护机制 (1)呼吸保护：固氨菌以较强的呼吸作用迅速地将周围环境中的氧消耗掉， 使细胞周围微环境处于低氧状态，并以此来保护固氮酶不受氧的损伤。 (2)构象保护：高氧分压下，固氮酶能形成一个无固氮活性但能防止氧伤害 的特殊构象。 呼吸与构象两种保护互相协调，形成“双保险”机制。在一般含氧条件下， 呼吸保护就可除去多余氧：若还有过量分子氧，可利用构象保护使固氮酶免遭损 唐。 但是对于一种特殊的蓝细菌来说，这种保护就不怎么管用了，因为它会因光 合作用放出氧，而使细胞内的氧浓度总刚增高，所以好氧自生固氨菌的保护机制 对他就没有用了。那么，它是怎么抗氧的呢？ 2、蓝细菌周氮酶的抗氧保护机制 (1)分化出特殊的还原性异形胞 异形胞：壁厚、细胞外有一层由糖脂组成的较厚的外膜，该膜具有防止氧气 扩散进入细胞的物理屏障功能，缺乏产氧光合系统2、超氧化物歧化酶活性很高
使异形胞内维持在很强的还原态：有解除氧毒害的功能，而且由于它的呼吸强度 高，可通过呼吸消耗过多的O2并产生固氮所需ATP。因此蓝细菌的固氮作用只 有在异形胞中才能进行。 (2)非异形胞蓝细菌固氮酶的保护 对于没有非异形胞的蓝细菌它的抗氧有多种形式：①利用时间差解决同氯酶 厌氧和光合放氧的矛盾，即在黑暗下固氮，在光照下进行光合作用（织线蓝细菌 属)：②提高细胞内S0D和过氧化物酶活性，消除有毒过氧化物，保护固氯酶活 性（粘球粘细菌属）。③或在其中央处于厌氧环境的微氧环境下进行固氮作用，即 进行空间上的分割。 除此之外呢，我们所对于人类研究非常透彻而且对我们贡献非常大的根瘤菌 的抗氧保护机制也有一定的研究。 3、豆科植物根瘤菌固氮酶的抗氧保护机制 通过研究发现，根瘤菌固氮时，根瘤菌以只能生长不能分裂的周氮活性很强 的类菌体(bacteroids)形式存在于豆科植物的根瘤中，类菌体被包在类茵体周 膜中，此膜的内外都存在着一种独特的豆血红蛋白质，只有这种蛋白出现了，根 瘤菌才开始固氮。该蛋白具有极强的吸氧能力，可使近血红蛋白处的氧浓度比周 围环境降低8万倍，以防止类菊体周围氧浓度过高使固氮酶失活。豆血红蛋白通 过氧化态和还原态间的变化可发挥缓冲剂的作用，借以使O2维持在低而恒定的 水平上。 三、肽聚糖的生物合成 肽聚糖是绝大多数原核生物细胞壁的独特组分。它对维持细菌细胞结构和正 常生命活动起着重要作用。许多抗生素如青霉素、头孢霉素的抗菌作用就是通过 阻止细菌肽聚糖合成而实现的。 肽聚糖是由“双糖五肽”单体聚合而成的网状大分子。它的合成反应在细胞 质、细胞膜及细胞膜外3个部位进行。 第一阶段：在细胞质中合成“单糖五肽 由葡萄糖逐步合成N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺，再由N-乙酰胞壁酸合成 N-乙酰胞壁酸五肽。 第二阶段：在细胞膜中合成双糖五肽和甘氨酸肽桥
这一阶段包括N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸五肽结合生成妝聚糖单体和类 质载体的再生。 由于细胞膜属于疏水性的，而上一步合成的N-乙酰胞壁酸五肽是亲水性的， 因此要想让这一分子顺利通过疏水性的细胞膜必须通过一种类脂载体的运送。类 脂载体通过两个磷酸基与八-乙酰胞壁酸分子相连。 N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸五肽结合成双糖五肽亚单位后，由于类脂载 体的结合，使这种亲水分子变成亲脂分子顺利地通过细胞膜转移到膜外，同时类 脂载体被释放。它在焦磷酸化酶的作用下，可以重新作载体。这是第二步 杆菌肽抑制剂就可以抑制这一步的反应，它可以阻止类脂载体的再生。而万 古霉素这是抑制类脂载体的释放。 第三步是双糖五肽单体在细胞膜外连接“编织成肽聚糖网” 肽聚糖单体先利用转糖基作用使多糖链横向连接一个双糖单位，在通过转肽 作用使两条多糖链间形成甘氨酸五肽桥而发生纵向交联。这一过程是在转肽酶的 催化下进行的。 青霉素的作用正是在这一步反应，它可以与转肽酶结合，使转肽作用不能进 行，即肽聚糖单体之间不能形城肽桥，从而使新合成的细胞壁的机械强度变差， 极易破裂，使细胞死亡。但是如果某些细胞正处于生长休止期，不存在这些大分 子的旺盛合成，这时青霉素对这种细胞是没有用的 最后一种微生物特有的合成代谢类型就是微生物次生代谢物的合成。 四、微生物次生代谢物的合成 微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命 活动的物质和能量的过程称为基础代谢。次生代谢是相对于基础代谢而言的，它 是指微生物在一定的生长时期以基础代谢产物为前体，通过支路代谢合成一些对 微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次生代谢的产物既不参与细胞的组 成，又不是酶的活性基团，也不是细胞的储存物质，而且大多分泌于胞外。 那么，我们就要想了，它产生这些次生代谢物对自己没有任何的用处，为什 么在长期的进化过程中还是会产生这些物质呢？其实很简单，我们可以理解为是 因为微生物长期的在自然界中生存，和动物、植物还有人类形成了非常密切的关 系，这就是他对大自然和对我们人类的一种回报。当然这种回报一定是有好有坏
了。就看我们怎么利用它了。比如说： 维生素类 细菌、酵母菌、霉菌、放线菌的一些种类，在特定的条件下会合成维生素。 比如说：丙酸杆菌可以产生维生素B12:分支杆菌可以产生维生素B6:酵母菌的 细胞中也含有大量的B族维生素，如维生素B1、B2,还含有维生素D的前体麦 角固醇，经过紫外光照射就可以变成维生素D。醋酸细菌和以合成维生素C。在 医学临床上利用的各种维生素，主要是利用微生物合成提取的。 抗生素类 抗生素是生物在其生命活动中产生的能特异性抑制其它生物生命活动的次 生代谢产物及人工衍生物的总称。一定种类的微生物只能产生一定种类的抗生 素。目前已发现的抗生素大多是放线菌产生的，但细菌、真菌也都可以产生抗生 素。抗生素以广泛应用于临床、农业及畜牧业生产上。 生长激素类 生长激素是有某些细菌、真菌、植物合成，能刺激植物生长的一类生物活性 物质。已知有80多种真南能产生哚乙酸。真菊中的赤看南所产生的赤霉素是 目前广泛应用的植物生长激素。菱白黑粉菌能产生哚乙酸，而5406放线菌既 能生产抗生素也能生产生长激素。 毒素 微生物在代谢过程中产生的一些对动植物有毒的物质称为毒素。破伤风芽孢 杆菌、白喉棒杆菌、痢疾志贺氏菌、伤寒沙门氏菌等病原微生物都可以合成毒素。 大多数细菌毒素是蛋白质，有外毒素和内毒素两类。苏云金芽孢杆菌可以合成对 许多昆虫有毒杀作用的半胞晶体，即6内毒素。 影响人类健康的看菌毒素已知有几百种以上，有的毒性很强，如黄曲萄产生 的黄曲毒素等。 色素 许多微生物在培养中能合成一些带有不同颜色的代谢产物。它所形成的色 素，有的留于细胞内，有的排到周围培养基中，所以有细胞内色素和细胞外色素 之分。许多细菌产生光合色素，有的产生虽不溶性色素，使菌落呈各种颜色：有 的产生水溶性色素，是培养基着色
由以上的介绍可知，微生物的次生代谢产物很多，资源丰富、潜力很大，但 是其中的大部分都没有很好的利用，因此对于人类来说他还有很好的、极其广阔 的利用前景。 由于微生物生长繁殖的代谢途径是多种多样的，要是在竞争中生存下去就需 要依靠复杂的调节系统，一方面严格的控制代谢活动，使之有条不紊、协调有效 地进行，另一方面能灵活的适应外界环境的变化。 然而，微生物的代谢是有各种各样的酶类催化的，因而代谢的调节主要是通 过控制酶的合成合活性而实现的。 第三节微生物代谢的调节 正如我们估计的一样，微生物细胞内的确有一整套可塑性极强和极精确的代 谢调节系统，以保证上下种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢 反应。其中最重要的就是酶的调节。这些在生物化学中有详细地介绍，在这里我 们只是简单说一下。首先，我们就米学习酶合成的调节。 微生物的代谢调节 酶合成的调节 酶合成调节是通过控制酶的合成量调节代谢速率的调节机制。这是一种在基 因表达水平上的调节。 (一)诱导一凡能促进酶生物合成的调节 根据酶合成与底物的关系将酶分为组成型与诱导型两类。 1.组成酶是细胞固有的酶，其合成受相应基因控制，与底物、底物结构类似 物及环境条件无关，它主要用于调节初级代谢。 2诱导酶是细胞为适应外来底物或底物结构类似物而临时合成的酶。如 E.co1i在含乳糖培养基上产生的B-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶就是由乳糖 存在而诱导产生的。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物。底物、难以代谢的底 物结构类似物及底物前体均可作为诱导物。 合成的诱导分为协同诱导与顺序诱导两种类型。协同诱导指一种底物能同 时诱导几种酶的合成。顺序诱导指先合成分解底物的酶，再依次合成分解各中间 产物的酶，也就是不需要的酶先不合成，待需要时再合成。从而达到对复杂代谢 途径的分段调节
(二)阻遏—阻碍酶生物合成的调节 在微生物的代谢过程中，当某途径的末端产物过量时，可通过阻碍该代谢途 径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，彻底控制代谢和末端产物合成。阻 遏作用有利于微生物从合成源头节省有限的养料与能量。阻遏可以分为： 1、终产物阻遏 末端产物阻遏指某代谢途径末端产物过量紫积引起的阻遏。在直线反应途径 中，末端产物阻遏较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使这些酶不能 合成。 2、分解代谢产物阻遏 分解代谢物阻遏指细胞内同时有在两种底物（碳源或氮源）时，大多数情况 下，能使细胞生长最快的那一种被优先利用，而分解另一种底物的酶的合成被阻 遏，这就称为分解代谢产物阻遏。其实质并非易利用底物直接导致，而是易利用 底物分解过程中产生的中间代谢物或末端代谢物的过量崇积，阻遏了分解难利用 底物代谢途径中一些酶的合成。例如：大肠杆菌在有葡萄糖和乳糖的培养基上生 长，大肠杆南肯定是先利用葡萄糖，同时阻遏于分解乳糖有关的酶的合成，只有 当葡萄糖被利用完以后，才开始利用乳糖。导致所谓“二次生长现象”。 (三)酶合成调节的机制 (1)操纵子-“操纵子”(operon)指的是1组功能相关的基因。它由启动 基因(promoter)、操纵基因(operator)和结构基因(Structural gene)3部分组 成。 在诱导物（一种效应物）存在时才发生转录、翻译，合成诱导酶的操纵子称为 诱导型操纵子。在缺乏辅阻過物（一种效应物）时才发生转录、翻译的操纵子称为 阻遏型操纵子。阻遏型操纵子编码酶的合成，只有通过去阻遏作用才能启动。 (2)诱导物与辅阻遏物：是一类低分子量的信号物质，它们可与调节蛋白结 合，使之发生变构，提高或降低与操纵基因的结合能力。诱导物是起始酶诱导合 成的物质，辅阻遏物是阻遏酶产生的物质。常被总称为效应物。 (3)阻遏酶蛋白：是一种调节蛋白、变构蛋白，具有两个特殊位点。其一与 操纵基因结合，其二与效应物结合，调节蛋白与效应物结合后会发生变构作用。 通过变构，调节蛋白与操纵基因的结合力发生变化（提高或降低）。调节蛋白分为