课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第八讲) 章节标题：第一节病毒 原核生物病毒-噬菌体 目的要求：1.了解并掌握噬菌体的形态结构和化学组成。 2.了解噬菌体的群体形态。 3.掌握噬菌体形态结构具有高度对称性的特点 4.掌握噬菌体效价的测定方法及一步生长曲线 教学重点：1.噬菌体效价的测定方法 2.噬菌体的一步生长曲线 教学难点：噬菌体一步生长曲线的制作方法 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配 1.噬菌体的增殖过程 25分钟 2.噬菌体效价的测定 25分钟 3.噬菌体的一步生长曲线 25分钟 4.溶原菌的特点 20分钟 5.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年3月21日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第三章病毒 (一)微生物病毒当中原核生物的病毒一噬菌休 噬菌体在自然界分布很广，从一般土壤、污水、粪便、腐烂的有机物、患病 植株及发酵工厂下水道等处均可分离到。发酵工业中，常出现噬菌体能响产品的 产量、质量甚至停产。由于噬菌体对寄主的专一性较强，一种噬菌体通常只侵染 一种细菌的个别品系，因此可通过换种的方法防止噬菌体的危害。如果两种细菌 可被一种噬菌体侵染，这可以说明两种细菌的亲缘关系较近。所以可以用已知的 噬菌体鉴定未知菌体或做细菌分类。 噬菌体是原核生物病毒的总称，包括噬细菌体、噬放线菌体、噬蓝细菌体等 类型。根据外形噬茵体可分为（画成括号图）蝌蚪形、球形、线型3种：根据结 构又可分为A、B、C、D、E、F6种，其中A、B、C均为解蚪形，A型有可收缩长 尾，B型有不可收缩的长尾，C型有不可收缩的短尾：D、E型均为球形，D型12 个顶角各有一个较大的衣壳粒，E型各顶角壳粒较小：F型为无头的丝状。大多 数噬菌体无包膜，仅有个别脂质包膜。绝大多数噬菌体都是DA噬菌体。 1.噬荫体的增殖 噬菌体的繁殖仅仅是核酸、蛋白质的合成和装配的过程。它包括5个阶段： (1)吸附：在这一阶段嗞荫体首先要吸附到宿主细胞上。表现为环境中的噬 菌体与其特异的宿主发生偶然碰撞（这一过程是有一定特异性的，因为我们前血 说过了噬菌体的专一性较强)，噬菌体的尾丝与宿主上的特异性受体互相识别， 这是原本卷紧的尾丝就会散开，通过它的刺突和基板固定在细胞表面，这就完成 了吸附过程。 (2)侵入：接下来吸附在宿主细胞表面上的噬菌体就要想办法侵入到宿主细 胞内部。这时尾丝收缩，基板收到这个信息以后，促使尾鞘紧缩成原长的一半， 尾管会自然地被推出并插入寄主的细胞壁和细胞膜中。但是细胞壁和细胞膜都是 细胞的保护屏障，他们具有一定的机械强度，而且还有肽聚糖等多糖组成的致密 网络，但是噬菌体只有办法，他尾管前端所携带的少量溶菌酶可溶解细胞壁中的 肽聚糖，有利于它的侵入。尾管插入后，头部的核酸迅速通过尾管注入宿主细胞 中，蛋白质躯壳就留在细胞壁外了。 植物病毒：通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞：或者
靠携带有病毒的媒介，主要靠有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。 动物病毒：①完整病毒穿过细胞膜的移位方式：②细胞的内吞功能：③毒粒 包膜与细胞质膜的融合。 (3)增殖：一个噬菌体侵入后显然微不足道，势单力薄。因此就要大量的增 殖才能达到致病的目的。这里就包括了核酸的复制和蛋白质的合成。这是它就和 宿主细胞自身的核酸一样，会利用它所携带的遗传信息向宿主细胞发出指令，并 利用细胞内一切有利于它的物质进行复制和自我装配，形成大小、形状完全一样 的子代噬菌体 至于噬菌体是如何合成的？书上给我们举了T偶数双链D小A噬菌体的例子： 在这里我们要知道增殖过程中基因表达特点： 基因表达有先有后 基因表达的顺序为：早期表达：次早期表达：核酸复制：晚期表达 前一次表达产物是后一次表达的MRNA聚合酶 晚期表达的结果是合成了各种装配蛋白（另外还有溶菌酶） 核酸进入细胞以后，利用宿主细胞内原有的R聚合酶形城噬菌体的早期 mRNM,这样有早期mRNA进行转译形成特有的早期蛋白，这当中就包括合成次早 期蛋白的mRNA聚合酶和可以将宿主细胞中原有的RA聚合酶更改成专门转录噬 菌体基因的酶叫做更改蛋白。之后，就利用早期蛋白中新合成的和更改后的RA 聚合酶来合成次早期mRA和次早期蛋白（这些次早期蛋白就包括用于DNA转录 的DNA酶以及合成晚期蛋白的mRA聚合酶等)，利用次早期蛋白合成的各种酶类 产生了晚期的mRNA和各种蛋白同时亲代DNA也进行了复制。至此，噬菌体核酸 的复制和各种蛋白质的生物合成就完成了。 (4)装配：即是将各种零部件装配形成新的噬菌体的过程。 (5)裂解：当细胞中产生大量赅菌体以后，宿主细胞就会发生裂解，大量子 代噬菌体就会被释放。这是少量噬菌体侵入细胞中的情况。如果是大量噬菌体同 时吸附在同一细胞上，那么噬菌体释放的溶菌酶在它还来不及繁殖时很快就会将 宿主细胞溶解，这样就不会产生大量的子代噬菌体，这种情况叫做自外裂解（从 外面将细胞裂解)。 通常噬菌体完成以上整个过程的时间也不过15-20分钟，时间非常短，这种
噬菌体叫做烈性噬菌体。有些噬菌体感染细菌后并不增殖，也不裂解细胞，这种 噬菌体叫做温和噬菌体。 2.噬菌体效价的测定 噬菌体效价：表示每毫升试样中所含有的侵染性噬菌体粒子数 噬菌体侵入宿主细胞后，由于复制导致宿主细胞裂解，释放出的子噬菌体又 继续侵染周围的寄主细胞，结果是经过液体培养的混浊的菌悬液由于细胞裂解而 变得透明，或在培养基上出现透明的噬菌斑。如果每一个噬菌体产生一个噬菌斑 这个局在固体培养基上形成的噬菌斑数，可以测得每毫升试样中所含有的侵染性 噬菌体粒子数。 但是，试样中实验中一般噬菌体含量较高，所以直接用这种方法是不行的。 应先进行稀释，在测定效价。测定的方法有： (1)双层平板法： 这是一种普遍采用并能精确测定效价的方法。事先分别配制含2%琼脂的底 层培养基和1%琼脂的上层培养基。先将底层培养基7-8L铺成平板，在将上层 培养基3mL在试管中溶化并冷却至45℃，加入0.2mL较浓的对数期敏感南和 0.1l待测噬菌体稀释液，充分混匀立即倒在底层拼板上铺平，待凝固后保温培 养，10多小时以后可进行噬荫斑记数。 优点：加了底层培养基可避免因培养皿底部不平而造成的缺陷：因为上层培 养基较薄这样不至于使噬南斑发生重叠现象：同时由于上层培养基比较烯，噬菌 体容易扩散，会形成形态较大，特征较明显的噬菌斑。这种方法测定的是所有噬 菌体的总数。 (2)单层平板法： 在双层平板法中省略底层，但培养基中的琼脂浓度和量比双层法中的上层 大，此法简便、省料，但难以准确定量。 (3)斑点试验法： 它是一种半定量的预实验法。先将敏感的寄主菌浓悬液涂布于合适的培养基 平板上。平板面朝下，在45℃左右的温箱中干燥，使平板表血不留水膜。在把 不同稀释度待测试样依次用接种环点种在平板上。保温数小时后，根据点样后是 否产生噬菌斑可初步判断试样的效价
(4)液体稀释管法： 这与用于细菌活菌记数中的系列稀释法相似。不同的是：各试管中均加有培 养液（活菌记数只用无菌水，但用培养液是让活菌继续生长）：各试管中均需接 种入处于对数期的寄主细胞（让噬菌体侵染）：以不长菌的最高稀释管来测定效 价（不长菌说明全部被噬菌体裂解） (5)玻片快速法： 将噬菌体和敏感寄主细胞与适量的含0.5%-0.8%的琼脂培养基泥合，涂布在 无菌载玻片上，短期培养后在显微镜或放大镜下记数。此法速度快但精确度差 每种噬菌体的噬菌斑有一定的大小、形状、边缘特征和透明度，可用来做菌 种鉴定。噬菌斑也不仅仅是用于噬菌体的分离和记数，也用于噬菌体的检出和鉴 定。 3.一步生长曲线 描述烈性噬菌体生长规律的曲线。先将噬南体与敏感细菌混合（比例为1： 10)发生吸附，未吸附的噬菌体以离心法或加抗血清除去：然后定时取样接种在 有可裂解的敏感性细菌的平板上，经培养，计数光亮、透明的空斑一噬菌班。以 时间为横座标，噬菌斑数为纵座标绘图，所得曲线即为一步生长曲线。这一过程 分为几个时期： (1)潜伏期：从噬菌体核酸进入寄主细胞到底一个成熟粒子装配前。这是正 在进行核酸和蛋白质的合成，尚未装配。这时我们看到培养皿上的现象是噬菌斑 数目不增加。潜伏期有可分为隐晦期（采用人工裂解液如氯仿裂解细胞。裂解液 仍无感染性，噬菌体核酸正在复制，蛋白质衣壳正在合成)和胞内紫积期（裂解 液已呈现侵染性，噬菌体粒子开始装配)。 (2)裂解期：潜伏期后几分钟取的样，噬菌斑数目突然急速增加，表示噬菌 体已装配成熟，并裂解细胞释放出来了。由于宿主细胞的裂解是不同步的，所以 这一时期持续较长时间。用潜伏期的噬菌斑数（感染噬菌体的细菌数）除裂解期 的噬菌斑数（噬菌体的释放数），便得到裂解量，即每个被感染细菌释放的新噬 菌体颗粒的平均数。 (3)平稳期：宿主细胞全部被裂解，噬菌体数目在高处达到稳定。 从一步生长曲线，不仅能了解噬体在菌体内的最短潜伏期和平均裂解量，还
可帮助测知理化因素对噬菌体感染循环时间和菌体释放噬菌体的影响。 4.溶原性 我们前面讲过，与烈性噬菌体相对应的有一种温和噬菌体。温和噬菌体侵染 敏感细胞与细菌共存的特性叫溶原性。这一类细菌叫溶原菌。他能与温和噬菌休 长期共存。 (1)温和噬菌体有三种存在形式： 游离态：游离的并具有感染新的病毒粒子 整合态：噬菌体DNA整合到寄主DNM中，形成前噬菌体，与寄主DNM一起复 制。（溶原菌中的噬菌体就是这种状态） 营养态：经外界因素诱导后，前噬菌体脱离寄主DNM处于积极复制、合成和 装配的状态。 (2)溶原菌具有以下基本特征： 稳定性：溶原南通常很稳定，将整合到自己DNA上的前噬菌体作为遗传结构 的一部分，随细菌DNA一起复制，能够经历很多代。 免疫性：溶原性细南对同源噬南体具有免疫性（即不会被这种噬菌体感染）， 这种免疫性具有高度的特异性。他的免疫性是由于前噬菌体的基因编码产生一种 阻遏蛋白，阻止了噬菌体大部分基因的表达，抑制了噬南体DA的复制和结构蛋 白的合成 裂解：溶原性细菌中少数前噬菌体自发脱离细菌细胞染色体，进行增殖，最 后导致细胞裂解。这种现象称为溶原性细菌的自发裂解。如经紫外线、X射线、 丝裂酶素等理化因子处理发生高频率裂解现象，称为诱导或诱发裂解。实验室常 用这些理化因子诱导溶原菌产生噬菌体。这种中断溶原状态进入溶菌性周期的过 程，我们把它叫做前噬菌体的切离，切离是与整合相反的过程，需要由切离酶进 行。也有极少数的溶原性细菌的前噬菌体离开染色体，不进入增殖周期就失去溶 原性，成为溶原性细菌的复愈或非溶原化。 溶原转变：噬菌体DA整合到细菌基因中改变了细菌的基因型，使细菌某 些性状发生改变，成为溶原性转变。某些细菌毒素的产生、以及抗原结构和血清 型都可受溶原性控制。如白喉棒杆菌不产生毒素，但当其被B-棒杆菌温和噬菌 体感染而溶原化后，由于后者带有毒素蛋白的结构基因，可编码毒素蛋白，因而
变成产白喉毒素的致病菌，细菌一旦失去该噬菌体着失去产毒能力。 λ噬菌体是常见的温和噬菌体。由于溶原性广泛存在于细菌中，因此有必要 专门为溶原性菌株命名。通常是在敏感菌株的名称后加一个括号，其中写上溶原 性噬菌体的名称。如E.co1iK12(入)表示的是一株带有入噬菌体的大肠杆菌K12 溶原性菌株。 要检验某种菌株是否是溶原性菌株，可以将少量溶原菌与大量敏感性指示菌 混合，与琼脂培养基混匀倒平板，经过培养后溶原菌就会长成菌落。因为分裂过 程中少数个体会自发裂解，释放出的温和噬菌体会不断侵染与溶原菌混合的敏感 指示菌，这是溶原菌周围的指示菌会发生裂解，但溶原菌不会所以就形成了溶原 菌在中间形成菌落而周围是一圈透明圈的形态
