课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第二十三讲) 章节标题：第三节基因重组和杂交育种 第四节基因工程 目的要求：1.了解原核生物基因重组的特点和类型 2.了解真核生物基因重组的特点 3.掌握基因工程的概念 教学重点：1.真核、原核生物基因重组的特点和类型 2.基因工程的概念 教学难点：真核、原核生物基因重组的特点和类型 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： 1.原核生物基因重组的特点和类型 35分钟 2.真核生物基因重组的特点 35分钟 3.基因工程的概念 25分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年5月14日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第三节基因重组和杂交育种 基因重组：两个独立的基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起， 形成新的稳定基因组的过程，叫做基因重组。 自然养的微生物可通过多种途径进行基因重组，并通过基因的重新组合以适 应随时改变的环境以求生存，这种重组不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且 也发生在微生物与高等动、植物之间，例如：最近发现的引起人体结核病的结核 分枝杆菌基因组上有8个人的基因，获得这些基因可以使该菌抓抗人体的免疫防 御系统，而得以生存。因此基因的重组是普遍存在的，是生物进化的重要动力之 一。我们也可以利用基因重组的方式进行体外和体内的杂交育种，己获得性状令 我们更加满意的菌种。 、原核生物的基因重组 原核生物的基因重组通常只是部分遗传物质的转移与重组，有片断性、单向 性和转移机制多样等特点。方式主要有转化、转导、接合及原生质体融合。 (一)转化 1928年，Griffith发现肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的转化 现象，目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。 定义 转化：受体菌直接吸收来自供体菌的DM片断，通过交换将其整合到自己的 基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象叫转化。 转化子：经转化后出现了供体遗传性状的受体细胞，既转化成功的菌株称为 转化子。 转化因子：转化现象是由转化因子引起的，转化因子指有转化活性的外源 DNA片断。它是供体菌释放或人工提取的游离DNA片断。转化因子须具备两个条 件，较高的相对分子质量和同源性。一般以双链较多，单链少见。供体菌和受体 菌亲缘关系越近，DA的纯度越高，越易转化。 感受态：受体菌需要处于感受态才具转化能力。感受态是指细菌能从周围环 境中吸收外源DNA片断并实现转化的生理状态。它可以通过感受态因子与细胞表 面受体相互作用后形成，也可由生长条件诱导形成。一般出现在细菌对数生长的 中、后期。主要有受体菌的遗传性所决定，因此并非所有细胞都能转化。另外还
与细菌的菌龄与培养条件有关 关于细菌转化的感受态有两种学说：一种局部原生质化假说，认为细胞壁能 阻碍转化因子进入受体菌，在某种条件下，细菌局部失去细胞壁，转化因子就能 通过细胞膜进入受体菌。另一种酶受体学说，认为感受态细胞的表面出现一种能 结合DNA并能使之进入细胞的麝， 感受态细胞除了摄取线状染色体DNA以外，也能吸收质粒DNA和噬菌体DNA, 这叫做转染。 以上的这种转化是自然转化，自然转化现象我们说了首先是在肺炎链球菌中 发现的(1928年，见第一节)，70多年米已经发现许多细菌属中的某些种或某些 株有自然转化的能力。近十多年来的研究已表明，通过自然转化进行的基因转移 过程已不只是一种“实验室现象”，而是广泛存在于自然界，可能是自然界进行 基因交换的重要逸径。环境中（士壤、水体、沙粒等）是否能发生自然转化，主要 取决于环境中是否存在具有转化活性的DNA分子及可吸收DA的感受态细胞。研 究表明，几乎所有的生活细菌都可向环境中主动分泌或细胞死亡裂解而释放 NA,这些DNA分子可与固型物（土粒、沙粒子）结合而得到保护，免受DNase的 降解，从而能长时间存留于环境中并具有转化活性，另一方面，自然感受态作为 许多细菌应付不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中的存在具有普遍性， 有实验表明，在有些环境中感受态细胞在其群落中的比例可高达16%。 那么从自然转化中我们得到了启发，为什么不能利用细菌的这种性质为我们 人类所利用呢，我们也可以将我们需要的某种性状，通过将控制这种性状的基因 转化到受体细胞中，使这种对我们有利的性状在供体菌种得以表达。当然这一切 就要在实验室中进行。 人工转化 这是在实验室中用多种不同的技术完成的转化，包括用CC12处理细胞，电 穿孔等。为许多不具有自然转化能力的细菌（如大肠杆菌）提供了一条获取外源 DA的途径，也是基因工程的基础技术之一。 1970年由Mandel和Higa首先发现可以用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为 能摄取外源D小A的感受态状态，30年来这种方法已广泛用于以大肠杆菌为受体 的重组质粒的转化（见第十章），但根据有关实验表明，线状的细菌DNA片段却难
以转化，其原因可能是线状DA在进入细胞溶质之前被细胞周质内的DNA酶消化， 缺乏这种DNA酶的大肠杆菌株能高效地转化外源线型DNA片段的事实证实了这 点。有关C2+诱导的机制目前还不十分清楚，一般认为可能与增加细胞的通透 性有关。 电穿孔法(electroporation)对真核生物和原核生物均适用。现在已用这种 技术对许多不能导入A的G和G+细菌成功的实现了转化。所谓电穿孔法是用 高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子（包括DA)能通过这些小孔 进入细胞，所以又称电转化，该方法最初用于将NA导入真核细胞，后来也逐渐 用于转化包括大肠杆菌在内的原核细胞。在大肠杆菌中，通过优化各个参数（电 场强度、电泳冲长度和DNA浓度等)，每微克DNM可以得到109-10转化体。但由 于C2+诱导法简便，价廉，因此仍为实验室中大肠杆菌转化的常用方法。 (二)转导 1952年，辛德和莱德伯格在实验鼠伤寒沙门氏杆菊能否进行接合作用时发 现了转导。 1.定义 转导：通过缺陷型噬菌体将供体菌的D小A片断携带到受体菌中，使后者获得 前者部分遗传性状的现象。 转导子：通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞成为转导子。 转导可分为普遍性转导和局限性转导二种类型。在普遍性转导中，噬菌体可 以携带供体菌上的任何一段基因将它转导至受体细胞中：而在局限性转导中，噬 菌体总是携带少数同样的片段到受体细胞中。 2.普遍转导 噬菌体侵入寄主细胞后，通过复制和合成，将寄主DA降解成很多小片断， 进入装配阶段。正常情况下，噬菌体将自身的A包裹在衣壳中，但也有异常的 可能，它误将寄主细胞的D八A的某一片断包裹进去，这样的噬菌体叫缺陷噬菌体 体内仅含有供体DNA的缺陷噬菌体叫做完全缺陷噬菌体，同时含有两种DNA的叫 部分缺陷噬菌体。这种异常情况出现的几率是很低的，但由于噬菌体产生的子代 数量很多，所以这种情况还是时常出现的。当包裹有寄主D八A片断的噬菌体释放 后再度感染新的寄主，其中供体菌的DA片断进入受体菌，并通过基因重组使受
体菌形成稳定地转导子。 普遍性转导可出现两种情况： (1)完全普遍转导 进入受体菌的供体菌DA片断与受体菌染色体同源区段配对，通过双交换整 合在染色体上，随者受体菌的分裂，每个子细胞都含有这个片断。 (2)流产普遍转导 进入受体菌的供体菌D八A片断不与受体染色体整合，也不能复制，仅能转录 而得到表达。细胞分裂后两个子细胞中只有一个细胞能得到来自供体菌的DA 片断，另一个子细胞只获得供体菌基因的产物酶，可在表型上出现供体菌的特 征，但随着细胞分裂次数的增多，该酶越来越少，最终又成受体菌原来的状态。 3.局限转导 指通过某些部分缺陷的温和噬菌体将供体菌的少数特定基因携带至受体菌 的转导。被转导的特定基因共价的与噬南体DA连接，与噬菌体DNA一起复制、 切割、包装、感染受体细胞后，整合进宿主染色体形成稳定的转导子。 它只能转导一种后少数几种基因，一般为整合位点两侧的基因。如入噬菌体 侵入大肠杆菌KI2菌株后，其DA整合在细菌D八M的与合成生物素和发酵半乳糖 有关的基因间，使寄主细胞溶原化。如果该溶原性细菌因诱导发生裂解时，释放 的噬菌体大多数是正常的，极少数由于不正常的切割带有合成生物素或发酵半乳 糖的基因，而将磁菌体的DA中的一段留在寄主细胞上。带有以上两种基因的部 分缺陷噬菌体再侵染缺乏这两种基因的受体菌，就是原来不能合成生物素或不发 酵半乳糖的细菌，具有合成生物素的能力或发酵半乳糖的遗传性状。 根据转导子出现频率的高低，局限转导可分为两类： (1)低频转导 入噬菌体，就是一种低频转导。这种只能产生极少数的部分缺陷噬菌体，用 它感染的宿主细胞也只有极少数能成为转导子，大部分都还是正常的。 (2)高频转导 当一种被称为双重溶原菌（同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的细菌）被 诱导时，就会产生含有等量的正常噬菌体和缺陷噬菌体，这时用这种裂解物去感 染受体菌，那么在受体菌中会有50%成为转导子，这种转导叫高频转导
4.溶原转变 这是一种和局限转导形成的现象相似的但在本质上截然不同的遗传现象。它 是指当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶原化时，因噬菌体基因整合到 宿主的基因组上，而使宿主获得了新的遗传性状的现象 (三)接合 1.定义 接合：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DA的过程 称为接合（有时也称“杂交”）。 接合子：通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，叫做接合子。 该过程是在1946年由Joshua Lederberg和Edward L.Taturm通过使用细菌 的多重营养缺陷型（避免回复突变的干扰），进行的杂交实验得到证实的。二株多 重营养缺陷型菌株只有在混合培养后才能在基本培养基上长出原养型菌落，而未 混合的二亲菊均不能在基本培养基上生长，说明长出的原养型菌落（由营养缺陷 型恢复野生型表型的菌株形成的菌落)是两菌株之间发生了遗传交换和重组所 致。 Lederberg等人的实验第一次证实了细菌之间可发生遗传交换和重组，但这 一过程是否需要细胞间的直接接触则是由Davis的“U”型管实验证实的（图 8-15)。U型管中间隔有滤板，只允许培养基通过而细菌不能通过。其二臂盛有 完全培养基，当将两株营养缺陷型分别接种到U型管二臂进行“混合”培养后 没有发现基因交换和重组（基本培养基上无原养型菌落生长），从而证明了 Lederberg等观察到的重组现象是需要细胞的直接接触的。 2.大肠杆菌的4种接合型菌株 大肠杆菌的接合与性菌毛有关。性菌毛是中空的，遗传物质可以通过性菌毛 进行转移。而后又发现大肠杆菌是有性别分化的，它的性别是由F因子，我们前 面讲过的致育因子决定的 (1)+菌株 雄性菌株，凡含有F因子的菌株，其细胞表面会产生1-4条中空而细长的性 菌手。 (2)F-菌株
雌性菌株，细胞中不含F因子，细菌表面也无性菌毛的菌株。这种雌性菌株 比较少见。 (3)F菌株 当H菌株细胞内的F因子因不正常的切离而脱离核染色体组时，可重新形 成游离的、但携带整合位点临近一小段核染色体基因的特殊F因子的菌株。 可以看出，除了F-菌株以外，其余三种菌株都以不同的方式携带着F因子， 因此都是雄性菌株。他们分别于雌性菌株接合会产生以下不同的结果。 下+与F-菌株的接合 Hfr与F-菌株的接合 F与F-菌株的接合 (四)原生质体融合 上面讲的三种遗传学技术和原生质体融合都叫做体内基因重组。它是指重组 过程发生在细胞内。这是相对于体外D八A重组技术（或基因工程技术）而言。体内 基因重组育种是指采用接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使 微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合，或者导致多倍体的出现， 从而获得优良菌株的一种育种方法。该方法在微生物育种中占有重要地位。尤其 是70年代以米发展起米的原生质体融合技术为微生物育种开辟了一条新的途 径，成为重要的育种手段之一。 原生质体融合技术是将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内及属间）融合 为一个新细胞的技术。主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再 生和融合子选择等步骤。 (1)原生质体制备 将两亲株分别用酶处理，使细胞壁全部消化或使薄弱部分破裂，原生质体即 可从细胞内逸出。为了防止原生质体的破裂，要把原生质体释放到高渗缓冲液或 培养基中。各种微生物的原生质体制备过程中，所用来破壁的酶也不同，细菌主 要用溶菌酶，酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶或纤维素酶。 (②)原生质体融合和再生 制备好的二亲本原生质体可通过化学因子诱导或电场诱导进行融合。化学因 子诱导的原生质体融合，最成功并且至今为人们所经常使用的是以
PEG(polyethyeneglycol,聚乙二醇)作为融合剂。PEG具有促进原生质体触合的 作用。加入PEG后，再加入C2+和Mg2+等阳性离子。原生质体的融合受各种阳 离子和浓度的影响，与融合液的pH也有关，例如，在钙离子存在下，pH9,可得 到高的融合颜度，而缺乏钙离子时，低p,融合频度也高。 电融合技术是一项有效促成原生质体融合的手段。融合过程首先是原生质体 在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，然后，在加直流脉冲后，原 生质体膜被击穿，从而导致融合的发生。电融合的独到之处在于，融合过程可以 在显微镜的监视下进行，并可以在镜下挑出融合的原生质体：电融合为一个空间 定向、时间同步的可控过程，对细胞无任何毒害作用。 原生质休已经失去细胞壁，仅有一层厚约10m的细胞膜。它具有生物活性， 但不是正常的细胞，在普通培养基上不能生长。两个原生质体融合后，必须涂布 于再生培养基上，使其再生。所谓“再生“就是恢复细胞原来貌，能够再生长。 再生率常为百分之零点几至百分之几十。再生培养基以高渗培养基为主，增加高 渗培养基的渗透压或添加高于0.3mol/L的蔗糖溶液均可增加再生率。 (3)融合子的选择 在各菌落中选择融合子是很繁锁的，主要是依靠在选择培养基上的遗传标 记，有二个遗传标记互补，就可确定其为融合子。营养缺哈型标记选择是常规而 准确的选择手段。因为只有营养缺陷型得到互补后才可恢复正常生长。但应用原 生质体融合技术改良一些具有重要商品价值的南种时，利用营养缺陷型标记，往 往会造成一些优良性状的丢失，和所需代谢产量的下降，营养缺陷型的获得繁锁 费时，实践中人们采用了一些其它的方法。灭活原生质方法便是其中的一种。灭 活原生质体融合可以在很少或没有标记下进行，实验表明灭活亲株（单亲株或双 亲株)原生质体融合可以形成有生物活性的融合子，如在枯草芽孢杆菌中，用链 霉素灭活，在巨大芽孢杆菌中用热灭活，在天蓝链霉菌中用紫外线灭活，都获得 了成功。其重组率有的可接近或超过活亲株融合。此外，利用荧光染色也是一种 重要的方法，该方法是在双亲原生质体制备过程中，向酶解液中加入荧光色素使 其形成带有荧光色素的原生质体。 将融合的原生质体悬浮液置于带有显微操作器和落射荧光装置的立体型显 微镜下，挑选出融合的原生质体。个体上同时观察到双亲染色的两种荧光色素
即可判断为融合子。 原生质体融合技术的实际应用，其关键环节是准确地选出具优良性能的融合 子，而这个选择往往是上述几种方法相互配合使用。 二、真核微生物的基因重组 真核微生物可进行有性繁殖，所以D八A的转移和重组在许多方面是不同于原 核生物的。真核生物具有复杂的核，其基因组也是由许多染色体组成并且是线型 的，因此在基因的分配和分离方面具有更复杂的调节机制。 (一)有性杂交 指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生 新的遗传型后代的一种育种技术。常见的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢 子等。书上讲的例子就是利用子囊孢子这样一种单倍体细胞进行融合后形成多种 双倍体细胞，再在这多种双倍体细胞中选择有优良性状的杂种。 说的简单一点就是把两个亲本的优良性状通过有性杂交整合到一个菌株当 中，让这一个菌株同时表现两种优良的性状。 (二)准性杂交 通过准性生殖的方式进行杂交。准性生殖指两细胞融合后，不经减数分裂而 导致染色体单元化和基因重组的变异过程。他与有性生殖的不同之处在于：1. 重组体细胞和一般营养细胞形态相同，并不产生于特殊的囊器中。而有性生殖为 性细胞的结合，产生于特殊的囊器中。2.染色体的交换没有规律性，而有性过程 通过减数分裂进行基因交换和分配。 准性生殖过程包括异核体的形成、二倍体的形成、单元化3个阶段。 异核体形成： 二倍体形成：即核融合。 单元化：指双倍体在一系列有丝分裂过程中，一再发生个别染色体的减半， 直至最后形成单倍体的过程。在上述双倍体的遗传性状极不稳定的时候，就会发 生单元化的情况，形成个别具有新性状的单倍体。 对于一些没有有性生殖的菌类，我们可以采用其准性生殖的过程进行杂交育 种。 选择亲本
强制异合 移单菌落 检验稳定性 促进变异 前面讲到了几种体内重组技术，相对的体外重组技术就是下面要讲的基因工 程。 第四节基因工程 基因工程(genetic engineering)或重组DNA技术(recombinant DNA technology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经 过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产 物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作， 也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体D的技术。因此，基因工 程和重组DA技术有时也就成为同义词。 基因工程是在现代生物学、化学和化学工程学以及其他数理科学的基础上产 生和发展起来的，并有赖于微生物学的理论和技术的发展和运用，微生物在基因 工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现是本世纪生物科 学具有划时代意义的巨大事件，它使得生物科学获得迅猛发展，并带动了生物技 术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作 大规模生产基因产物，并且去设计和创建新的基因、新的蛋白质和新的生物物种， 这也是当今新技术革命的重要组成部分。 一、首先来了解一下基因工程的历史 基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因1 程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DA的分子克隆和DNA的快速 测序 早在50年代，阿尔伯(Arber)的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的 噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰-限制系统，即给宿主自 身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体D八A。1970年史密斯(Smith)等人 从流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)中分离出特异切割DNA的限制酶。 次年，内森斯(athans)等人用该酶切割猴病毒SV40DNA,最先绘制出DNA的