课程名称：微生物学 班级：生物工程031 (第二十二讲) 章节标题：第二节基因突变和诱变育种 目的要求：1.了解基因突变的类型 2.了解突变育种的方法 3.学握突变的特点 教学重点：1.基因突变的类型 2.突变的特点 教学难点：关于基因突变的自发性和不对应性的证明 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： 1.基因突变的类型 25分钟 2.突变育种的方法 45分钟 3.突变的特点 25分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年5月9日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第二节基因突变和诱变育种 突变指遗传物质发生数量或结构变化的现象。它导致的性状改变叫变异。 广义的变异包括基因突变和染色体畸变。 一、基因突变 狭义的变异仅指基因突变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换导 致遗传性状变化，一般这种变化的范围很小，因此又叫点突变。 作为遗传物质的核酸一般都比较稳定，但在某些情况下也会发生改变引起可 遗传的变异。发生了突变的菌株叫突变体或突变型：未发生突变的原来的菌株叫 野生型。 (一)突变类型 1.形态突变型 是指造成形态改变的突变型，包括影响细胞和菌落形态、颜色以及影响噬茵 体的噬南斑形态的突变型，这是一类非选择性突变，因为在一定条件下，它既没 有像抗性突变那样的生长优势，也没有像营养缺陷性和条件致死突变那样的生长 劣势，形态突变和非突变型均同样生长在平板上，只能靠看得见的形态变化进行 筛选。其中以颜色变化较易筛选，例如：用携带有B-半乳糖苷酶的Mu转座因子 引起的插入突变，在含有xgal(⑤-bromo-r-chloro-3-indolyl-B -Dgalactoside)的平板上可显示兰色菌落或噬菌斑，使易于鉴别和分离。DNA重 组技术中常用的pC载体系列和受体系统是通过B-半乳糖苷酶基因的插入失 活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。 2.生化突变型 发生了代谢途径的变异，但是没有明显的形态变化。 (1)营养缺陷型： 一种缺乏合成其生行所必须的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中 获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长。 营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，由于 这类突变型在选择培养基（或基本培养基）上不生长，所以是一种负选择标记， 需采用影印平板(Replica plating)的方法进行分离，步骤如下： ①将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型菌株和突变株
均能生长的主平板（含完全培养基）上，经培养后形成单菌落（图8-9）： ②通过一消毒的“印章”（直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布，使其尽 量平整)将A平板的菌落分别原位转移（或印迹）到C平板（含有与A平板相同的营 养成份)和D平板（不含缺陷型所需的营养因子，即基本培养基） ③经培养后对照观察c和d平板上形成的单菌落，如果在c平板上长而在d 平板上不长的，则为所需分离的突变型： ④在c平板上挑取d平板上不长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养 基上划线分离纯化。 (2)抗性突变型 由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生索，产生抗性的一种 突变，普遍存在于各类细菌中，也是用来筛选重组子和进行其它遗传学研究的重 要正选择标记。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变株能生长。所以很容 易分离得到。 (3)发酵突变型 指从能够利用到不能利用某种营养物质的突变型。如野生型大肠杆菌可以发 酵乳糖，但也能分离到不能发酵乳糖的突变体，可以利用鉴别培养基呈现的反应 进行检测。 (4)毒力突变型 突变后致病能力增强或减弱的突变型。 (5)产量突变型 产生某种代谢产物的能力增强或减弱的突变型。 3.条件致死突变型 是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 类因为这类基因一旦发生突变是致死的（例如为DA复制所必需的基因）。常用的 条件致死突变是温度敏感突变，用ts(temperature sensitive),表示，这类突 变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。筛 选ts突变型的方法也是采用影印平板法，所不同的是教材中图8-9中的三个平 板上培养基相同，均可生长。只是将C和D平板分别置低温(30℃)和高温(42℃) 下培养，然后在C平板上挑取相应于D平板上未生长的菌落
4.致死突变型 指突变后生活力丧失或下降导致死亡的突变型。由于活体仅见于隐性杂合子 的双倍体个体，故研究的很少。 以上这些突变型当中营养突变型、抗性突变型和条件致死突变型是选择性突 变株，这一类突变株能够通过选择性培养基或其他选择性培养条件快速选择出 米。而形态突变型、抗原突变型和产量突变型属于非选择性突变株，原因见形态 突变型。 (二)突变率 突变率是指某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。一般不同的突 变型采用不同的方法检验。 (三)基因突变的特点 这里以细菌的抗药性为例说明基因突变的特点。 1.自发性和不对应性 这种性状的突变可以在没有任何人为的诱变因素处理的情况下，发生在生物 的任何个体的任何发育时期及任何基因上。这又叫基因突变的随机性。即基因突 变的方向与引起突变的条件没有直接的对应性。 (四)基因突变及其机制 突变是DA分子结构或数目的变化.根据引起变化的原因可分为自发突变和 诱发突变：根据DA变化的程度分为基因突变（一对碱基）和染色体畸变（一段 染色体)。 作为遗传物质的核酸分子是非常稳定的，故其突变具有稀有性。但由于某些 原因，仍能发生变化而引起形状改变。自然条件下自发进行的突变叫自发突变： 人为诱发引起的突变叫诱发突变。自发突变率低，诱发突变率高，后者广泛用于 菌种选有。 1.诱发突变 就是实验室常常使用的诱变。人为的引起诱发突变的理化因素叫做诱变剂。 根据核酸变化引起遗传信息的变化量大小，可以分为碱基置换、移码突变和 染色体畸变。 (1)碱基置换：是由DNA分子中碱基对置换引起的，是染色体的一种微小损
伤。它包括两种方式，分别是嘌呤被嘌呤代替或嘧啶被嘧啶代替，叫转换：还有 嘌呤被嘧啶代替叫颠换。 常用的诱变剂有： 1)碱基类似物(Base analog) 例如：5-溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）和2-氨基嘌呤（腺嘌呤结构类似 物)，在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构 体的频率高，因此出现图8-10所示的碱基错配的机率也高，从而提高突变频率 2)直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂 最常见的有亚硝酸、羟胺和烷化剂。亚硝酸能引起含N2基的碱基(A.G.C) 产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变。羟 胺NH2OD几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC一T的转换。甲磺酸乙酯 (ethyl methane sulfonate,EMS)和亚硝基胍(nitroso guanidine,TG)都属于 烷基化试剂，其烷基化位点主要在鸟嘌吟的7位和腺嘌呤N-3位上，但这两个 碱基的其它位置以及其它碱基的许多位置也能被烷化，烷化后的碱基也像碱基结 构类似物一样能引起碱基配对的错误。亚硝基肌是一种诱变作用特别强的诱变 剂，因而有超诱变剂之称，它可以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1%， 而且能引起多位点突点，主要集中在复制叉附近，随复制叉的移动其作用位管也 移动。此外，硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)、乙基磺酸乙酯(ethyl ethane sulfonate,EES)以及二乙基亚硝酸胺(diethyl nitrosamine,DEN)等也都是常用 的诱变烷化剂。 (2)移码突变 指DA分子中增添或缺失少数几个碱基对，而造成后面遗传密码发生转录和 翻译错误的基因突变。 遗传信息是以3个核苷酸为一组的密码子形式表达的.所以一个或几对核苷 酸的增减往往造成该部位以后的密码子意义改变 例如：GGG AAA UUU AAA CCC 甘 赖苯丙赖脯 当一个核苷酸发生变化是，前面加一个A时，就变为
AGG GAA AUU UAA ACC C 精谷异亮终止 密码子全部移动，导致合成不正常的蛋白质，引起性状改变 有时候，由于核苷酸的变化不是单一的，即有时增加一个然后又缺失一个， 会造成只在增加和缺失之间的一段密码子不正常，然后又恢复正常的情况。即书 上209页表示的这几种情况。 移码突变可自然或人工产生。自然产生发生于减数分裂时的不对称交换， 个配子里少一个或数个碱基，另一个配子里多相应数目的碱基。人工一般用丫啶 染料作为诱变剂。 这是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的 扁平分子。所以它们是通过插入DNA分子的碱基对之间，使其分开，从而导致 DM在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DM插入和缺失的机率，导致 突变率的增加，常引起移码突变。溴化乙锭和吖啶橙是这类诱变剂的代表。 (3)染色体畸变 由于某些理化因素的作用造成DA分子的大损伤所引起的突变。包括染色体 的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。 这种畸变分为染色体内和染色体间的。染色体内畸变只涉及一条染色体上的 变化，部分染色体的缺失或重复导致基因的减少或增加，易位和倒位导致基因排 列顺序的改变。倒位是断裂下的染色体片断旋转180度后重新插入原位。易位是 断裂下来的一段染色体顺向或逆向插入同一条染色体的其他部位上。染色体间畸 变是非同源染色体间的易位。 在这么多畸变类型当中易位是非常重要的一种方式，它既可以发生在同一条 染色体上，也可以发生在两条染色体之间。我们又把这一现象叫做转座。凡是具 有转座作用的一段DM序列叫做转座因子。 转座因子是细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒的一个位点转到另 一个位点，或者在二个复制子之间转移)的一段DA序列。广泛存在于原核和真 核细胞中（表8-3），由美国遗传学家Barbara MeClintock首先在玉米中发现， 并荣获1983年度诺贝尔奖。原核生物中的转座因子有三种类型：插入顺序 (insertion sequence,IS)、入转座子(transposon,Tn)和某些特殊病毒（如
Mu、D108)。IS和Tn有二个重要的共同特征：它们都携带有编码转座酶 (transposase)的基因，该酶是转移位置，即转座(transposition)所必需的： 另一共同特征是它们的二端都有反向末端重复序列(inverted terminal repeat,. ITR),该序列的长度为40bp(主要是IS)到1000bp以上（某些Tn). IS是最简单的转座因子，分子大小范围在250~1600bp左右，只含有编码 转座所必须的转座酶的基因。它们分布在细菌的染色体、质粒以及某些噬菌体 DNA上。 转座子(Tn)比IS分子大，与Is的主要差别是Tn携带有授予宿主某些遗传 特性的基因，主要是抗生素和某些毒物（如汞离子）抗性基因，也有其它基因，如： T951携带有负责乳糖发酵的基因。根据转座子二端结构的组成可将其分为二种 类型。第一种类型是转座子二端为顺向或反向重复的[S,药物抗性基因位于中 间，IS提供转座功能，连同抗性基因一起转座，T5是这一类型的代表，称为复 合转座子(compound transposon.)或类型I转座子。这一类型的转座子实际上是 IS因子的延仲。第二种类型的转座子的两端为短的反向重复序列(I),其长度 一般为30-50bp,在二个IR之间是编码转座功能和药物抗性的基因（或其它基 因)，这类转座子称为类型Ⅱ或称复杂转座子(complex transposon),Tn3是这 一类型的典型代表。 噬菌体是一种以大肠杆菌为宿主的温和噬菌体，以裂解生长和溶源生长 两种方式交替繁衍自己。其基因组上除含有为噬菌体生长繁殖所必需的基因外， 还有为转座所必需的基因，因此它也是最大的转座因子，全长约39张b,图8-7 显示u噬菌体的遗传图谱。从图谱中可看出u基因组的实际长度只有37.2kb 因为该DNA分子的两端并不是像IS和Tn那样的反向重复序列，而是宿主DNM 序列。左端的宿主DNA约为50-150bp,右端是1-2kb,这也是Mu噬菌体不同于 其它噬菌体的独特之处。两端的宿主DNA是由于进入裂解循环的uDNA进行外壳 装配时，是从随机插入的u基因组C端及其相邻的50-150bp的宿主DNA开始 自到与S端相邻接的1-2kb的宿主DNA为止，也就是C端50-150bp的宿主DNA 加37.2kb的Mu基因组和1-2kb的S端宿主D八A被包装进外壳蛋白，而且由于 Mu插入的位点不同，所以几乎每一个噬菌体颗粒结合着不同的宿主DA序列
转座因子的转座可引发多种遗传学效应。这些效应不仅在生物进化上有重要 的意义，而且已成为遗传学研究中的一种重要的工具。这些遗传变化主要包括： (1)插入突变 当各种IS、T等转座因子插入到某一基因中后，此基因的功能丧失，发生 突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子 后半部分结构基因表达失活。如果插入的是带有抗性（或其它）基因的转座子，则 可获得带有新的基因标记的插入突变。 (2)产生染色休畸变 由于复制性转座是转座子一个拷贝的转座，处在同一染色体上不同位置的二 个拷贝之间可能发生同源重组，这种重组过程可导致DA的缺失或倒位，即染色 体畸变 (3)基因的移动和重排由于转座作用 可能使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子 或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子，具 有生物进化上的重要意义。 引起染色体畸变的原因有很多： 1)紫外线 紫外线(ultraviolet,简称UV)是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，DNA 具有强烈的紫外吸收能力，尤其是核酸链上的碱基对。紫外线的大剂量为杀菊剂， 小剂量为诱变剂。其作用机制也了解得比较清楚，包括使DNA链断裂、DNA链间 或链内交联。由V引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体(dimer),阻碍碱基的 正常配对而导致碱基置换突变。另方面当细胞用一种称之为$0$的倾向错误 (error prone)的修复系统（见后面）来修复损伤时，还会导致高频率的突变。 2)x-射线、r-射线，快中子 x-射线、r-射线，快中子等属于电离辐射，作用机理尚不十分清楚，与UW 不同的是电离辐射可通过玻璃和其它物质，穿透力强，能使碱基间或糖与磷酸间 的化学键断裂，因此常用于动物和植物的诱变育种。 3)热 短时间的热处理也可诱发突变，据认为热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿
嘧啶，从而导致GC一AT的转换，另外，热也可以引起鸟嘌呤脱氧核糖键的移动， 从而在DA复制过程中出现包括二个鸟嘌呤的碱基配对，在再一次复制中这一对 碱基错配就会造成GC→CG颠换。 (4)生物诱变因子 转座因子（前面己讲过）也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组 的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断 突变，而且由于转座因子T、u带有可选择标记（抗生素抗性等），因此可容易 地分离到所需的突变基因 自发突变 不经诱变剂处理而自然发生的突变称自发突变。 引起自发突变的原因很多，包括背景辐射和环境因素引起的、微生物自身代 谢有害产物引起的等等。无论是什么原因最终都是由于DNA复制过程中碱基错配 引起的。这当中包括，由DNA聚合酶产生的错误，D八A的物理损伤，重组和转座 等因素。但是这些错误和损伤将会被细胞内大量的修复系统修复，使突变率降到 最低限度。自然突变的一个最主要的原因是碱基能以称之为互变异构体(taumer) 的不同形式存在，互变异构体能够形成不同的碱基配对，因此在DA复制时，当 腺嘌吟以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌呤进行正确配对(A-T):如果以亚 氨基(imino)形式（互变异构）出现时，则与胞嘧啶配对，这意味着C代替T插入 到DNM分子中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么DM分子中的A-T碱基对 就变成了G-C(图8-10)。 同样，胸腺嘧啶也可因为由酮式到烯醇式的异构作用而将碱基配对由原来的 A-T变成了G-T,即鸟嘌吟取代了腺嘌吟，经复制后便导致T→GT的转换。所谓 转换(transition))是嘌吟到嘌呤（如图8-l0中的AT→GT)或嘧啶到嘧啶的碱基置 换，如果是嘌岭到嘧啶（如AT→CG)或嘧啶到嘌岭的变化则称之为颠换 (transversion).。 此外，在DNA复制时，由于在短的重复核苷酸序列发生的DNA链的滑动 (slippage)而导致一小段DA的插入或缺失也是产生自发突变的原因。碱基偶尔 会从核苷酸移出而留下一个称之为脱嘌呤(apurinic)或脱嘧啶(apyrimidinic) 的缺口，该缺口在下一轮复制时不能进行正常的碱基配对，其原因被认为是胞嘧
啶的自然脱氨基(deamination)而形成了尿嘧定所致，因为尿嘧啶不是D八A的正 常碱基而将被DNA修复系统识别而被除去，结果留下一个脱嘧啶位点。最后，自 发突变还有一个很重要的原因就是由能够随机插入基因组的转座因子引起的。而 且如果在基因组上存在二个或多个拷贝，则会发生同源重组，进而导致缺失，重 复和倒位。 (五)DNA损伤的修复 上面我们讲到了，在生物细胞中存在非常复杂而庞大的修复系统，正是因 为他们的有在才使得突变的发生幸非常低。我们知道DM聚合酶除了有从5-3 端的DA复制功能，还有3-5端核酸外切酶的纠错功能，随时进行错配碱基的 校正。这里以我们研究的比较详细的紫外线引起的嘧啶二聚休的修复为例。 突变与育种 在生物进化过程中，微生物形成了愈来愈完善的代谢调节机制，使细胞内复 杂的生物化学反应能高度有序地进行和对外界环境条件的改变迅速作出反应。因 此，处于平衡生长，进行正常代谢的微生物不会有代谢产物的积素。而微生物育 种的目的就是要人为地使某种代谢产物过量积紫，把生物合成的代谢途径朝人们 所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，实 现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。为了实现这 目的必须设法解除或突破微生物的代谢调节控制，进行优良性状的组合，或者利 用基因工程的方法人为改造或构建我们所需要的菌株。 自发突变与育种 利用自发突变来育种通常是我们在实验室中不会采用的方法，因为这种方法 费时费力而且主要是效果难以预测。 一般会在生产中经过长期的生产和观察，分离到一些生产性状优于原株的产 量突变株。但这需要富有经验和善于观察的人来做，而且常常是可遇不可求的。 还有一种就是通过定向培育的方法。就是让微生物发生自发突变，然后通过一些 选择性的条件找到我们需要的某些性状的突变株，在经过不断移植，从而选育出 较优良的菌种。前面讲到的影印平板培养法就可以筛选出链霉素抗性菌株。 (二)诱变育种 诱变育种是指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率
