课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第二十一讲) 章节标题：第一节遗传变异的物质基础 目的要求：1.了解物质在细胞内的存在部位和存在方式 2.了解并掌握原核微生物质粒概念、应用及分离与鉴定 3.了解原核微生物质粒的分类 教学重点：1.原核微生物质粒概念、应用及分离与鉴定 2.原核微生物质粒的分类 教学难点：原核微生物质粒概念、应用及分离与鉴定 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： L.遗传物质在细胞内的存在部位和存在方式 20分钟 2.原核微生物质粒概念、应用及分离与鉴定 45分钟 3.原核微生物质粒的分类 30分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年5月7日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第一节遗传变异的物质基础 二、遗传物质在细胞内存在部位和方式 原核生物与真核生物中D八A存在形式不完全相同。要从7个层次上来探讨： (一)7个层次 1、细胞水平 从细胞水平看，每个细胞都存在着该生物的全套遗传信息，绝大多数都聚集 于细胞核中。真核微生物的核外有核膜，叫真核。原核微生物和外无核膜，叫拟 核或原核，也叫核质体。有的细胞只有一个细胞核，如细菌中的球菌、酵母菌等： 有的有两个细胞核，如细菌中的大多数杆菌和真菌中的担子菌等：还有的有多个 核，如许多真菌和放线菌的菌丝休等。 2、细胞核水平 从细胞核水平看，真核微生物的DM与蛋白结合在一起形成染色体。原核微 生物的DNA不与蛋白质结合形成松散无定形的染色质。 无论是真核生物还是原核生物，除细胞核以外在细胞质中，还存在着能自主 复制的遗传物质。真核微生物的细胞质中有中心体、线粒体、叶绿体等细胞器基 因和2μm质粒；原核微生物的质粒很多，常见的有致育因子(F)人、抗药因子() 以及大肠杆菌素因子。 3、染色体水平 不同生物核内染色体的数目不同。真核微生物细胞内染色体数目较多，而原 核微生物中只有一条。除染色体数目以外，染色体的套数也不同。如一个细胞中 只有一套染色体他就是一个单倍体。绝大多数微生物是单倍体。如果一个细胞中 含有两套功能相同的染色体，就叫双倍体。高等动植物的体细胞都是双倍体。在 微生物中少数如：酿酒酵母菌的营养细胞就是双倍体，还有单倍体性细胞接合或 体细胞融合后所形成的合子是双倍体， 4、核酸水平 (1)从核酸种类来看 大多数的遗传物质是DNA,只有少数病毒的遗传物质是RNA (2)从核酸结构来看 有双链和单链之分，绝大部分微生物的D小A双链的，少数病毒的DNA是单链
结构的：绝大多数的RNA是单链的，少数是双链的 (3)从核酸的长度看 DNA分子极长，如大肠杆菌的DNA分子有1.1-1.4m长，使其菌体长度的1000 倍。T2噬菌体的DNA长度为其头部直径的500倍。一般的真核微生物的DA比 原核微生物的长的多。 (4)从核酸的状态看 真核微生物的核内DNA是念珠状链：原核微生物中双链DA是环状，在细菌 质粒中呈麻花状，病毒粒子中双链DNA呈环状或线状，RNA分子都是线状的。 5、基因水平 基因是指生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，它是具有特定核苷酸 顺序的核酸片断。 根据功能，原核生物的基因可分为调节基因、启动基因、操纵基因和结构基 因。后3种通称为操纵子。 结构基因是指决定某种酶及结构蛋白质分子结构的基因，它所编码的蛋白质 合成与否受调节基因和操纵基因的控制。调节基因是能够调节操纵子中结构基因 活动的基因。操纵基因是能控制结构基因转录的开放或关闭。启动基因则是RA 聚合酶附着和启动的部位。 真核生物没有操纵子结构，这是它与原核细胞基因最明显的区别， 密码子水平 遗传密码是指DA链上特定的核苷酸排列顺序。基因中所带的遗传信息（核 苷酸排列顺序)通过RA传给蛋白质。遗传密码的单位是密码子，它由核酸分 子上3个连续核苷酸序列决定。A、C、G、U4种核苷酸3个一组可排列64种密 码子，其中，AUG为起始密码子，对应甲硫氨酸：UAA、UGA、UAG是蛋白质合成 的中止信号，就是书上说的无意义密码子，也叫终止密码。其余的分别对应出甲 硫氨酸以外的19种编码氨基酸。 这种编码关系在生物界是通用的。什么意思呢？比如说：人胰岛素基因转入 大肠杆菌体内，大肠杆菌就可以合成人的胰岛素。 2.核苷酸水平 核苷酸是核酸的组成单位，在绝大多数的微生物的DA中，都只含有腺嘌吟
核苷酸(AMP),鸟嘌吟核苷酸(GNP),胸腺嘧啶核苷酸(TMP)和胞嘧啶核苷酸 (CMP)4种脱氧核苷酸：在绝大多数RNA中，只含有腺嘌呤核苷酸(AMP),鸟嘌 呤核苷酸(GP),尿嘧啶核苷酸(LNP)和胞嘧啶核苷酸(CMP)4种核糖核苷酸。 但其中某一核苷酸的碱基发生变化，这导致一个密码子意义改变，进而导致 整个基因信息改变，直到合成新的蛋白质，引起性状改变。因此核苷酸是最小的 突变单位。 (二)原核生物的质粒 1.定义和特点 质粒是一种独立与染色体之外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存 在于各种微生物细胞中。 质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中，即cccDNA. 但是从细胞中分离的质粒大多是3中构型，即CCC型（麻花辫）、0C型（圆形） (open circular form)和L型（直线）(linear form)(黑板上划出形状)。 染色体DA作为细胞中的主要遗传因子，携带有在所有生长条件下所必需的 基因，这些基因有时称之为“持家基因”(housekeeping gene),而质粒所含的 基因对宿主细胞一般是非必需的，只是在某些特殊条件下，质粒能赋予宿主细胞 以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。例如抗药性质粒和降解性质粒能使宿 主细胞在具有相应药物或化学毒物的环境中生存，而且在细胞分裂时恒定的传递 给子代细胞。 2.质粒在基因工程中的应用 质粒目前作为基因工程研究的重点使用对象，它具有许多优点： 体积小，便于分离和操作，也便于导入。因为如果体积大的话，容易在分离 时断裂成线状。 绝大多数都是ccc和oc结构，分子无自由末端，呈紧密的缠结状态，稳定 性强。 有不受核基因组控制的独立复制起点，既可以单独复制。 拷贝数多，也就是在细胞中的个数多，可插入较多的外源DA。 由于抗药性基因的行在，在培养时可以将它作为选择性标记，即在培养基中 加入相应的药物或有毒物质，容易检出能抵抗这种物质的质粒，容易鉴别
3.质粒的分离与鉴定 根据质粒的分子大小和结构特征，通过超离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与 染色体DNA分开，从而分离得到质粒。 这是因为虽然染色体DA也是以超螺旋结构存在于细胞中，但其分子大小远 远超过质粒（例如：大肠杆菌染色体是4100kb,而Co1E1质粒只有9kb),因此在 分离过程中染色体DNA总是会断裂成线状，其两端可以自由转动而使分子内的紧 张态完成松弛。而小分子的质粒绝大多数是CCC或OC结构，共价闭环的质粒DA 分子无自由末端，分子是紧密的缠结状态，因此在含溴化乙锭(Ethidium bromide,简称EB,可与DNA和RNA分子结合，使其在紫外光照射下显现荧光， 便于观察或分离)的氯化铯梯度中，松弛的染色体DA结合的B分子比质粒多， 其密度也比质粒小，经高速密度梯度离心后，就可将二者分开，从而可分离得到 质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳则是根据分子量大小和电泳呈现的带型将染色体D八A与质 粒分开。前者也是因随机断裂成线状，且分子量大，所以泳动速度慢，带型也不 整齐：而后者分子量小，大小均一，泳动速度快，带型整齐，很容易将二者区分 并进而达到分离质粒DNA。 4.质粒的种类 根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，可将其分为各种不同的类 型： (I)致育因子(Fertility factor,F因子) 又称F质粒，其大小约100kb,这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖 现象（接合作用）有关的质粒。它决定细菌性别并具有转移能力。携带F质粒的菌 株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为下-菌株（相当于雌性）。下因 子能以游离状态(+)和以与染色体相结合的状态(H)存在于细胞中。F质粒整 合到宿主细胞染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence recombination,简称Hfr)。所以又称之为附加体(episome)。 F质粒在大肠杆菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。当Hfr菌株上 的F因子通过重组回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下 来，而成为携带某一染色体基因的F因子，例如F-lac、F-gal、F-pro等。因此
将这些携带不同基因的F因子统称为F',带有这些下”因子的菌株也常用F 表示。 (2)抗性因子(Resistance factor,R因子) 这是另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称厂 质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其他药物呈现抗性。例如 Rl质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、链每素(Streptomycin,Sml、磺胺(Sulfonamide,,Su)、氨苄青每素 (Ampicillin,Ap)和卡那霉素(Kanamycin,,Km),并且负责这些抗性的基因是成 簇地存在于R1抗性质粒上。 许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(T6+)、砷 (As3+)、汞Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。在肠道细 菌中发现的R质粒，约有25%是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75%。 (3)Col质粒 因这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基 因，大肠菌素是一种细南蛋白，只杀死近缘且不含Co1质粒的南株，而宿主不受 其产生的细菌素的毙响。 由G+细荫产生的细南素通常也是由质粒基因编码，这种细菌素的种类很多， 都按照其产生菌来命名，如大肠杆菌素或枯草杆菌素等等。有些甚至有商业价值， 例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用 于食品工业的保藏。 (4)毒性质粒(virulence plasmid) 现在越来越多的证据表明，许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起 的，这些质粒具有编码毒素的基因，例如产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻 的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。有些使 昆虫致病乃至死亡的细菌毒素也是由质粒编码的，苏云金杆菌产生的毒素是这种 类型的典型例子。研究表明，苏云金杆菌含有编码8内毒素（伴孢晶体中）的质 粒，伴孢晶体的结构基因及调节基因位于质粒上。 Ti质粒和Ri质粒，Ti质粒它是一种导致植物患病的毒性质粒。而Ri质粒 是会导致植物根部产生大量不定根的不具有毒性的质粒。但是，它们都可以将其
上所携带的任何基因片断整合到植物细胞的核基因组中，合成正常细胞没有的物 质，导致植物患病或增生。也正是因为如此，我们可以利用这一点让这种质粒携 带对我们有用的基因进入植物细胞当中，使植物的性状发生改变，目前广泛应用 于转基因植物中。 (5)代谢质粒(Metabolic plasmid) 这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因，含有这类质粒的细菌，特别 是假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形 式。尤其是对一些有毒化合物，如芳香簇化合物（苯）、农药(2,4-dichlorophenox yacetic acid)、辛烷和樟脑等的降解，在环境保护方面具有重要的意义（见第十 一章)。因此这类质粒也常被称为降解质粒，每一种具体的质粒常以其降解的底 物而命名。如樟脑质粒(camphor,CA)、辛烷质粒(octadecane,.OCT)、二甲苯 质粒(xylene,XYL)等。 此外，代谢质粒中还包括一些能编码固氯功能的质粒（就是书上说的mega 质粒)。例如根瘤菌中与结瘤(nod)和固氨(fix)有关的所有基因均位于这种共生 质粒中。放线菌中也已发现许多大的线型质粒（一500kb以上）含有抗生素合成 的基因。 (6)隐秘质粒(cryptic plasmid) 以上所讨论的质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，但隐秘质粒不显示任 何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液 等方法才能发现。他们存在的生物学意义，目前几乎不了解。酵母的2m质粒 不授予宿主任何表型效应，也属于隐秘型质粒。 除了根据质粒赋予宿主的遗传表型将质粒分成不同类型外，还可根据质粒的 拷贝数、宿主范围等将质粒分成不同类型。例如：有些质粒在每个宿主细胞中可 以有10-100个拷贝，称为高拷贝数(high copy number)质粒，另一些质粒在每 个细胞中只有1-4个拷贝，为低拷贝数Low copy number)质粒。前者又称松弛 型质粒(relaxed plasmid),后者又称严谨型质粒(stringent plasmid),此外， 还有一些质粒的复制起始点(origin of replication)较特异，只能在一种特定 的宿主细胞中复制，称为窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid):复制 起始点不太特异，可以在许多种细菌中复制，称为广宿主范围质粒(6 road host
range plasmid)。能整合进染色体而随染色体的复制而进行复制的质粒又称附加 体(episome)