课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第二十四讲) 章节标题：第四节基因工程 第五节菌种的复壮、衰退和保藏 目的要求：1.掌握基因工程的操作步骤及应用 2.掌握菌种复壮与保藏的方法 教学重点：1，掌握基因工程的操作步骤及应用 2.掌握菌种复壮与保藏的方法 教学难点：基因工程的操作步骤及应用 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： L.基因工程的操作步骤 35分钟 2.基因工程的操作应用 35分钟 3.菌种的复壮、衰退和保藏 25分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年5月16日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第四节基因工程 二、基因工程的基本操作 ①分离或合成基因： ②通过体外重组将基因插入载体： ③将重组DNA导入细胞： ④扩增克隆的基因： ⑤筛选重组体克隆： ⑥对克隆的基因进行鉴定或测序： ⑦控制外源基因的表达： ⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1来表示。 三、基因工程的应用 工业 农业 环保 医药 科研 四、微生物学与基因工程的关系 微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以 说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明： ①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成： ②基因工程所用下余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的： ③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先 构建穿梭载体，使外源基因或重组体DA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改 造，才能再转移到植物和动物细胞中： ④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达 载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的： ⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程 提供了极其丰言而独特的基因资源： ⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取
得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物 学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。 第五节菌种的衰退、复壮和保藏 菌种衰退与复壮 衰退的防止 在菌种未衰退前就采取一定的措施防止它的衰退，才是积极的措施。 菌种的复壮 菌种保斑 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定 时间内不死亡，不会被其它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性 状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏 是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意 义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会 (CCCCM),中国典型培养物保藏中心(CCTCC),美国典型菌种保藏中心(ATCC), 美国的“北部地区研究实验室”(NRRL),荷兰的霉菌中心保藏所(CBS),英国的 国家典型菌种保藏中心(NCTC)以及日本的大阪发酵研究所(IFO)等。国际微 生物学联合会(IAMS)还专门设立了世界菌种保藏联合会(WFGC),用计算机储 存世界上各保藏机构提供的菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进 行微生物菌种的交流、研究和使用。 生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不 例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条 件，使其行活而得以延续。例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种 或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令菌株 的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间 内得到保存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条 件使保藏物恢复活力。 1.传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常 用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针
对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于 菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微 生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。一般 来说，通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。 例如在菌株生长良好后，改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置 低温保存：将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其它缓冲液后，密封置4℃保存， 也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏 法。 由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变 而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在 般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的南种进行保有外，还必须根据 条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。 2.冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生 物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者 则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞， 尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰品小而 减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温 也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的能响。例如，05 ol/L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护 细胞：大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烧酮(PVP)虽不 能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采 用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮 保藏可达到一196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等 方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮 保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱保藏 使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在一70℃低温冰箱中保 存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感
受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可利用一2030℃的普通冰箱保存菌 种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于 冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强 烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意 经常检查保藏物的存活情况，随时转种。 3.干燥保藏法 水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干 燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。 (1)沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者 主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培 养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压 干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便 易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发 酵工厂采用。 (2)冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭 环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于 休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细 胞受损伤的程度相对较小，有活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌科 安瓿管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍， 也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要 的微生物保存手段 除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保 藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有 不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此， 在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件 等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不 同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失
