课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第十七讲) 章节标题：第二节微生物的生长规律 第三节环境因索对微生物生长的影响 目的要求：1.了解微生物的生长规律 2.掌握微生物的生长曲线及各个时期的特点 3.了解微生物生长的环境因素 教学重点：1.微生物的生长规律 2.微生物的生长曲线及各个时期的特点 教学难点：微生物的生长曲线及各个时期的特点 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： 1.微生物的生长规律 20分钟 2.微生物的生长曲线及各个时期的特点 40分钟 3.环境因素对微生物生长的影响 35分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年4月23日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第二节微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 由于微生物的个体十分微小，因此要单个研究每个个体的生长是一件十分困 难的事情。目前最直接的方法就是用显微镜观察细胞的超薄切片，这种方法不但 使用的仪器非常昂贵、复杂，而且需要不停的对细胞进行切片，十分不方便。比 较方便的是同步培养技术，即通过群体生长各阶段的变化来间接了解单个细胞的 变化规律。那么，这种了解只能是通过使细胞群体中的各个个体的生长处于步调 基本一致的情况下，这样表现出来的群体生长特性才能够代表个体，才具有研究 的意义。因此，这种通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调 致的生长状态，就叫做同步生长。 如何获得微生物的同步生长呢？主要应用的有两类方法： (一)诱导法（调整生理条件的同步法） 1.温度调整法-一将微生物的培养温度控制在接近最适温度条件下一段时间， 它们将缓慢地进行新陈代谢，但又不进行分裂。换句话说，使细胞的生长在分裂 前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培养温度提高或降低到最适生长温度，大多 数细胞就会进行同步分裂。人们利用这种现象已设计出多种细菌和原生动物的同 步培养法。 2.营养条件调整法-一即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。 例如：限制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续生长，从而 获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们便进入了同步生长。 对营养缺陷型菌株，同样可以通过控制它所缺乏的某种营养物质而达到同步化。 3.对于光合细菌可以将不同步的细菌经光照培养后再转到黑暗中培养，这样 通过光照和黑暗交替培养的方式可获得同步细胞：对于不同步的芽孢杆菌培养至 绝大部分芽孢形成，然后经加热处理，杀死营养细胞，最后转接到新的培养基里， 经培养可获得同步细胞。 (二)筛选法 处于不同生长阶段的细胞，其个体大小不同，通过各种孔径大小不同的微孔 滤膜过滤或密度梯度离心就可使大小不同的细胞群体在一定程度上分开，选择处 于同一生长阶段的细胞进行培养
离心方法： 将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡萄糖的不同梯度 溶液里，通过密度梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞 大致是处于同一生长期的细胞，分别将他们取出进行培养，就可以获得同步细胞 过滤分离法 将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同的微孔滤器，从而将大小不同的细 胞分开，分别将滤液中的细胞取出培养，获得同步细胞 3.硝酸纤维素滤膜法 这种薄膜可以吸附与它带相反电荷的细胞。将被吸附的细胞倒置于有新鲜培 养液缓慢流动的滤器中，细胞便开始分裂，分裂新形成的细胞则会被培养液洗脱， 收集洗脱的细胞，这些细胞就可以被看成是同步生长的细胞。 二、单细胞微生物的典型生长曲线 细菌接种到均匀的液体培养基后，开始进行分裂繁殖。在不补充营养物质或 移去培养物，保持整个培养液体积不变的条件下，一时间为横坐标，菌数为纵坐 标，根据不同培养时间里细菌数量的变化，可作出一条反映细菌在整个培养期间 菌数变化规律的曲线，这个曲线就叫做生长曲线。 一般典型的生长曲线都是单细胞微生物比如细菌和酵母菌的，对于丝状生长 的真菌和放线菌来说，它们的生长曲线是不同的。一条典型的生长曲线至少可以 分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个生长时期。 (一)延滞期 少量细菌接种到新鲜培养基中，由于它处于一个新的生长环境，需要一个适 应期，因此在一定时间里并不马上分裂，细菌的数量维持恒定，或只有很少量的 增加。特点： (1)生长速率常数为零 (2)细胞形态变大或增长 (3)细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性 (4)合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱 导酶 (5)对外界不良条件如NC1溶液浓度、温度和抗生素等化学药物等反应敏
感。 处于延滞期细菌的特征是细胞分裂迟缓，代谢活跃，细胞体及增长快，细胞 质均匀，细胞中的蛋白质和A含量高，对不良环境的抓抗力降低，容易产生各 种诱导酶等。 产生延滞期的原因是细胞接触新的环境后，需要重新合成必需的酶、辅酶或 某种中间代谢产物，以适应新的环境，为细胞分裂作准备。 延滞期的长短是不一定的，通常受3个方面因素的影响： 1.接种龄 指用于接种的某一群体的生长年龄。一般来说，如果以处于生长繁殖旺盛的 种龄的种子接种，那么子代培养物的延滞期就短：反之，如果用已经老化、衰退 的种子接种，则延滞期就长 2.接种量 接种量和延滞期的长短呈反比。接种量大，一般延滞期短。 3.培养基成分 接种前后培养基的成分如果变化大，则延滞期长：如果成分变化不大，可以 想象，细菌很容易适应新的环境，延滞期短。通常接种到营养丰富的培养基上细 菊的延滞期要比接种到营养单调的培养基上的延滞期短。 一般在工业发酵和科研中延滞期会增加生产周期而产生不利的影响，所以应 该采取一定的措施来缩短延滞期。综合对它的影响因素：(1)通过遗传学的方法 改变种的遗传特性使延滞期缩短：(2)利用对数生长期的细胞作为种子接种：(3) 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大：(4)适当扩大接种量缩短延 滞期，克服它带来的不良影响 (二)指数期 指细菌细胞经过延滞期的调整后，便进入快速分裂阶段，细菌按几何级数增 加，所以又叫对数期。此时细胞代谢活性最强，酶活力高而稳定，组成新细胞的 物质合成最快，生长速率最大，代时最短，对环境变化敏感， 几个概念： 生长速率常数R:是指单位时间内细胞数目或细胞生物量的增加，每小时的 分裂次数
世代：由一个细胞分裂成为2个细胞的间隔 代时(G,generation)):细胞每分裂一次所需时间或原生质增加一倍所需时 间 G=1/R,即一个世代所需的时间，也就是群体细胞数目扩大1倍所需的时间 也被称为倍增时间。 指数生长：每经历一个代时，细胞的数目就增加1倍，呈指数增加，因而被 称为指数生长。 不同细菌指数期的代时不同，同一种细菌在不同培养条件下，代时也不同： 影响代时的因素主要有： 1.菌种 不同菌种的代时不同。有的10-15min,有的半小时到一小时，还有的甚至 需要一天的时间。 2.营养成分 营养成分丰富，培养温度适宜，代时较短，反之则长。 3.营养物质浓度 当营养物质低于某一界限的时候，会影响微生物的生长速率和菌体产量。但 当营养物质浓度达到最低要求以后则生长速度就不受影响了，而这时他只影响最 终的菌体产量。这种营养物质就叫做生长限制因子。 4.培养温度 当微生物处在它的最适培养温度是，代时是最短的。 处于对数期的细菌细胞生长迅速，在形态、生理特性和化学组成等方血较为 一致，而且菌体大小均匀，单个存在的细胞占多数，因而适于用作进行生理生化 等研究的材料。由于旺盛生长的细胞对环境理化等因子的作用敏感，因而也是研 究遗传变异的好材料。在微生物发酵工业中，需要选取对数期细胞作为转种或扩 大培养的种子，以便缩短发酵周期和提高设备利用率。 (三)稳定期(stationary phase) 又叫恒定期或最高生长期。 特点：①生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数 相等，或正生长与负生长相等的动态平衡中
②菌体产量达到了最高点菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例 关系，细胞内开始积紫糖原、异染颗粒和脂肪等内含物，开始合成抗生素等次 生代谢产物，芽孢杆菌开始形城芽孢。 之所以存在稳定期的原因是：生长限制因子被耗尽：营养物的比例失调：有害代 谢产物积某；各种物理化学条件越来越不适宜等等。一般是这几种因素综合起来 造成的。 稳定期对于生产实践有者非常重要的指导意义： (1)是生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物乳酸等发酵生产的最佳收获 期 (2)是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳时期 (3)对稳定期的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创硅 (四)衰亡期或称衰老期 细南在经过稳定期后，由于营养和环境条件进一步恶化，死亡率迅速增加， 以致明显超过增殖率，这时尽管群体的总菌数仍然较高，但活菌数急剧下降，表 现为按几何级数下降，生长曲线直线下垂，有人又称其为对数死亡期。这个时期 的细胞代谢活性降低、细胞衰老并出现自溶（由于蛋白水解酶活力增强），常表 现为多形态，产生许多大小或形态上变异的畸形或退化型，其革兰氏染色亦不稳 定，许多G+细菌的衰老细胞可能表现为G-。 认识和掌握生长曲线，不仅对于指导发酵有很大作用，而对于科学研究也 是十分必要的。例如：为了得到研究材料，往往要顶计某一细菌群体生长到一定 数量水平需要多长时间，这时就要计算生长速率和代时。书上154页介绍了计算 方法。三、微生物的连续培养 连续培养是指在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能维持生长下去的的一种培养方法。它是与分批培养相对而 言的，分批培养中，培养基一次加入，不补充、不更换。随着细菌的活跃生长培 养基营养物质逐渐消耗，有害代谢产物积累，细菌的对数生长期不可能长期维持。 根据生长曲线，营养物质的消耗和代谢产物的积紫是导致微生物生长停止的主要 原因，因此在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物 是实现微生物连续培养的基本原则
具体地说就是通过两种方法：①当培养到指数期的后期时，以一定速度连续流入 新鲜培养基和通入无菌空气，立即搅拌均匀。②利用溢流的方式以同样的流速， 不断流出培养物（包括菌体及代谢产物），从理论上讲，对数生长期就可无限延 长。只要培养液的流动量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可 保证培养器中总菌量基本不变，使容器内的培养物达到动态平衡。 这种连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状 态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。此法已成为当前 发酵工业的发展方向。那么，连续培养并不像我们说起来这么简单，它也是需要 一些装置的。一般连续培养装置主要有恒浊器和恒化器两类。 1、恒浊器 是保持装置中的微生物有恒定浊度的（恒定密度）连续培养装置，这一点是 通过根据培养液细胞密度调节培养液流入的速率实现的。在这个系统中，当培养 基的流速低于微生物的生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调 解，可以促使培养液的流速加快。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率 进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大 量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。 2、恒化器 恒化器通过控制某种限制性营养物质的浓度调节微生物的生长速度及其细 胞密度，使装置内营养物质浓度恒定。在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的 增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互 相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平 衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量 却能保持稳定菌体密度的菌体。 以上是按照控制方式划分的连续培养装置。还有按照其他方式分的连续培养 器，如158页的。 连续培养如果用于生产实践，用于发酵工业，就叫连续发酵。这种生产方式 当然是值得被提倡的，因为它有单批发酵所不具备的优点，但是正是因为这些优 点也恰恰给它带来了不少的缺点。 高效，它把原来的分步操作变成了一个持续的过程，因此简化了装料、灭菌
出料、清洗发酵罐等许多重复的单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备 的利用率：但是，就是因为菌体这样连续、高速度的生长也导致了菌种容易退化， 这一点很容易想象，就像人无论是在进行脑力劳动还是进行体力劳动时，都不能 持续的不间断地进行，要休息，补充体力，否则人就会生病不能很好的工作，微 生物在这一点上其实也是一样的，只不过他这种退化是发生了某种不利于生产的 突变。 自控，便于利用各种仪表进行自动控制：但是在设备的长期运转中，容易出 现一些因为设备老化、维修不利而造成的杂菌污染，这对于连续发酵是非常不利 的，会导致整个过程重新来过。而且，由于无论流加的是培养基还是限制性营养 物质它都是一种动态的，因此，微生物对于营养物质的利用率不高。 ③产品质量较稳定， ④生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使 水、汽、电的负荷均匀合理。 四、高密度培养 进行高密度培养的方法有很多，这些方法可以单独使用，也可以综合起来使 用。 1.优化培养基 包括选取最佳培养基成分和优化各成分的含量 这就要求我们在进行培养实验时，除了参考已确定的培养基以外，还要根据 实际情况对培养基的成分、各成分的含量进行适当的添加或减少，使它更适应我 们的菌种和培养条件，这时必须通过多次实验才能确定的。 2.补料 就是指可以补充微生物生长所需要的一切营养物质。 3.提高溶解氧的浓度 有时候仅凭空气中的氧浓度是难以满足一些好氧菌对氧的需求的，这时可以 通入纯氧或加压氧的方式提高装置中的溶氧度，以提高菌体密度。 4.防止有害代谢产物的生成 前面我们讲过的，有些有害代谢产物可以抑制微生物自身的生长，那么我们 可以用去除或防止它生成的方法来解除这种抑制。一般也会以此作为依据来优化
培养基，用不会生成有害代谢物的物质代替某些培养基成分，或者是改变培养条 件来抑制有害代谢物的生成。 第三节环境因素对微生物生长的影响 微生物的生长除了营养物质是非常重要的因素以外，环境条件也不可忽视 没有适当环境条件轻则抑制它的生长，重则导致它的死亡，和不给它培养基是 样的道理。创造适宜的环境，可以促进有益微生物的生长：应用不利条件，可以 控制无益微生物的生长， 一、温度 影响微生物生长的重要因素。一方面，在一定范围内随着温度的上升，酶活 性提高，细胞的生物化学反应速度和生长速率加快，一般温度每升高10℃，生 化反应速率增加一倍，同时营养物质和代谢产物的溶解度提高，细胞膜的流动性 增大，有利于营养物质和代谢废物的排出：另一方面，机体的重要组成，如核酸、 蛋白质等对温度较敏感，随着温度的升高可遭受不可逆的破坏。 温度对微生物生长的影响具体表现在： ①对酶活性的毙响 微生物生长过程中所发生的一系列化学反应绝大多数是在特定酶催化下完 成的，每种酶都有最适的酶促反应温度，温度变化能响酶促反应速率，最终影响 细胞物质合成： ②影响细胞质膜组分的流动性 温度高组分流动性大，有利于物质的运输，温度低流动性降低，不利于物质 运输。因此温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌： ③影响物质的溶解度 物质只有溶于水才能被机体吸收或分泌，除气体物质以外，温度上升物质的 溶解度增加，温度降低物质的溶解度降低，最终影响微生物的生长。 具体到某一种微生物，则只能在有限的温度范围内生长，并具有最低、最适 和最高3个临界值。最低温度是微生物生长的下限，低于该温度微生物将停止生 长。一最适温度是使微生物生长繁殖最快的温度。但它不一定就是微生物一切代 谢活动最好的温度。最高温度是微生物正常生长的温度上限。直到前不久，人们 报道细菌最高生长温度为105℃，似乎生命的温度上限为100℃，也就是水的沸
点。而现在己有报道发现嗜热原核生物能在海底裂隙隆起处的硫化物喷出的部位 生长，从那里的超高温火山口喷出的水的温度高于350℃，有证据表明这些微生 物在这样高的温度下仍然可以生长察殖。原因就是这些原核生物的蛋白质、膜和 核酸具有很强的耐热性。 不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等 于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或紫积代谢产 物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度， (一)嗜冷微生物一般能在0℃或更低的温度下生长，超过20℃以上的温 度将抑制它们的生长发育。其生长的温度范围为-10℃~30℃，最适温度为10 ℃~20℃。如假单胞菌、乳酸杆菌、青霉等多分布在海洋、深湖、冷泉和冷藏库 中。 据研究嗜冷微生物在低温下能生长的原因是暗冷微生物的酶在低温下能更 有效的起催化作用，而温度达30-40℃会使酶失活：而且它们的细胞膜中含有较 多的不饱和脂肪酸，能在低温下保持膜的半流动性，从而保证了膜的通透性，有 利于微生物生长。 (二)嗜温微生物-生长温度范围是10~50℃，最适生长温度为20~40 ℃，是自然界中种类最多、数量最大的一个温度类群。 (三)嗜热微生物生长温度范围是25~80℃，以50~60℃为最适生长温度 (四)嗜高热微生物最适生长温度为80℃以上，分布在火山喷气口、热 泉，都是古细菌。 二、氧气 氧对微生物的影响很大，这一点不用多说。根据微生物和氧的关系可以将微 生物分为五类： (一)专性好氧微生物 也较好气微生物。他们缺氧便不能生长，因为氧是其呼吸作用的最终电子受 体：在同醇类不饱和脂肪酸的生物合成中也需要氧的参与。细胞含有超氧化物歧 化酶(S0D)和过氧化氢酶。 培养好氧微生物必须保证通气良好。振荡、通气、搅拌都是实验室和工业生 产中常用的供氧方法。很多细菌、放线菌、真菌都属于好氧微生物：