课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第十二讲) 章节标题：第三节营养物质进出细胞的方式 第四节培养基 目的要求：1.了解营养物质进出细胞的四类主要方式。 2.学握每一种运输方式的特点 3.了解培养基配置的原则和方法 4.掌握培养基的种类几个种类成分的特点 教学重点：1.营养物质进出细胞的主要方式 2.培养基的种类 教学难点：四种营养物质进入细胞方式的异同 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配 1.营养物质进出细胞的主要方式及其特点 40分钟 2.培养基配置的原则和方法 20分钟 3.培养基的种类 35分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年4月4日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第三节营养物质进入细胞的方式 环境中的营养物质只有吸收到细胞内，才能被微生物逐步利用。微生物在生 长中不断产生多种代谢产物，必须及时排到胞外，以避免在细胞内积累产生毒害 作用，微生物才能正常生长。 它们没有专门的摄食和排泄器官，营养物质主要是通过细胞的渗透屏障进入 细胞内部。渗透屏障主要由细胞膜、细胞壁、荚膜及粘液层组成。荚膜与粘液层 结构疏松，对营养物质吸收的影响较小。细胞壁对营养物质的吸收有一定影响 能阻挡分子过大的物质进入。 营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素： ①营养物质本身的性质（相对分子量、质量、溶解性、电负性等）②微生物 所处的环境（温度、PH等）：③微生物细胞的透过屏障（原生质膜、细胞壁、英 膜等)。 和其他因素相比，细胞膜是控制营养物质进入和代谢产物排出的主要屏障。 微生物一般直接吸收水溶性和脂溶性的小分子物质。大分子的营养物质，如多糖 蛋白质、核酸、脂肪等，必须经相应的胞外酶水解成小分子物质，才能被微生物 细胞吸收。 目前，根据对细胞膜结构及物质运输的研究结果，一般认为营养物质通过质 膜的方式有4种：单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团转移。 一、单纯扩散(Simple Diffusion) 单纯扩散也称被动扩散，它是由于细胞质膜内外营养物质的浓度差而产生的 物理扩散作用。由于进入细胞的营养物质不断被消耗，使细胞内始终保持较低的 浓度，所以胞外的营养物质能够源源不断地通过这种方式进入细胞内部。扩散是 非特异性的。扩散速度取决于营养物的浓度差、分子大小、溶解性、极性、p、 离子强度和温度等因素。营养物的扩散将使细胞内外的浓度差不断减小，直至两 者相等并达到动态平衡。 单纯扩散不需膜上载体蛋白参与，也不消耗能量，因此它不能逆浓度梯度运 输养料，而运输速度慢，运输的养料种类也十分有限。所以这种不太高明的方 式细胞自然不会选择他成为主要的运输方式。能以单纯扩敢方式进入细胞的物质 主要有水、溶于水的气和小的极性分子（如尿素、甘油、乙醇等）。大肠杆菌吸收
钠离子是依靠这种方式进行的。 二、促进扩散(acilitated Diffusion) 又叫协助扩散。养料通过与细胞质膜上的载体蛋白(Permease,或称载体蛋白) 的可逆性结合从高浓度环境进入低浓度环境的传递过程称为促进扩散（或书上的 概念)。促进扩散的动力仍然是养料在细胞质膜内外的浓度差，它不消耗能量， 同样也不改变最终达到膜内外浓度相等的动态平衡。 载体蛋白是位于细胞膜上的蛋白质，起着“渡船”的作用。他运送溶质的机 制是构型的改变。营养物质在胞外与载体的亲和力高，易于结合：进入细胞后亲 和力降低，将营养物质释放出来。由于有它的协助，促进扩散速度比单纯扩散要 快。该过程具有3个特点： ①特异性，即一定的载体蛋白只能与一定的养料离子或结构相近的分子结 合比如运输葡萄糖的载体只能运输葡萄糖： ②能提高养料的运输速度，提前达到动态平衡： ③当膜外养料浓度过高时，由于载体蛋白数量有限而表现出饱和效应。促 进扩散只对生长在高养料浓度下的微生物有意义。因为这种载体蛋白类似于酶的 作用，又叫渗透酶。这些酶大多数是诱导酶，只有在外界营养物质浓度较高时这 种酶才会被诱导而产生。 促进扩散的运输方式多见于真核微生物中。如厌氧生活的酵母菌，对葡萄糖 等物质的吸收就是通过这种方式。 三、主动运输(Active Transport) 微生物吸收营养物质的主要机制.其特点是被吸收的营养物质的运输输读不 受细胞膜内外浓度差的制约，可以逆浓度梯度运输，因此运输过程中要消耗能量， 其特点是： 特异性，即养料与载体蛋白间存在者专一对应的关系： 消耗能量： 逆浓度梯度运输： 能改变养料运输反应的平衡点。 这一过程是膜蛋白载体发生构型变化而被运送物质不发生任何变化。主动运 输是微生物在自然界稀薄的营养环境中能够获得营养物，正常生存的重要原因之
一。无机离子、有机离子和一些笳类（乳糖、蜜二糖及葡萄糖）通过主动运输进入 细胞。 如大肠杆菌吸收乳糖是以这种方式进行的，如果一旦细胞中的代谢能量停止产 生，这种运输方式也会随之停止。 四、基团转移(Group Translocation) 基团转移是另一种类型的主动运输。他同样需要特异性载体蛋白和能量消 耗，但养料在运输前后分子结构发生改变，因而不同于主动运输。基团转移主要 用于葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和嘌呤等物质。目前仅在原核生物中 发现该过程，主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细胞中。 大肠杆菌对葡萄糖和金黄色葡萄球菌对乳糖吸收都是通过这种方式。这些糖 在运输过程中发生了磷酸化作用，并以磷酸糖的形式存在与细胞质中。进一步研 究结果表明，磷酸糖中的磷酸来自磷酸烯酮式丙酮酸。因此，基团转移的运输方 式称为磷酸烯醇式丙刷酸-磷酸糖转移酶运输系统。简称磷酸转移酶系统。 这是一个十分复杂的运输系统。一般由4种不同的蛋白质组成：酶I、酵Ⅱ、 酶Ⅲ和HPr(热稳定载体蛋白)。酶I和HP工这两种蛋白是在所有运输糖的系统 中都起作用，酶Ⅱ和酶只对特定糖起作用。酶Ⅱ位于细胞质膜以外，其它三种 都在细胞质中。这一运输过程分两步进行： 热稳定载体蛋白(HPr)激活 细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基团通过酶I把PT激 活： 酶IHPr+PEP==P-P+丙酮酸 糖被磷酸化后进入质膜内 膜外环境中的糖先与外膜表面的酶Ⅱ结合，再转运至内膜表面。这时，糖被 P一Pr上的磷酸激活，通过酶Ⅱ作用将糖一磷酸释放到细胞内。 酶Ⅱ糖（细胞外）+P-HP==糖-P(细胞内)+HPr 其实，除了上述四种运输方式还有一种常见于原生动物中的运输方式叫做膜 泡运输。原生动物通过趋向运动靠近某种营养物质，并将该物质吸附到膜表血， 然后在这种物质附者处的细胞膜内陷，膜逐步包围这种物质，最后形成包囊，然 后包囊离开细胞膜而游离于细胞质中。如果膜泡中包的是固体物质，那么这种运
输方式就叫胞吞作用：如果包含的是液体营养物质，就叫胞饮作用 第四节培养基 人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为培养基。配 制好的培养基是科学研究、发酵生产微生物制品等方面重要的基础工作。培养基 含有微生物所需的6大营养要素（水分、碳源、氯源、能源、刊质元素和生长素） 和适宜的H、渗透压及氧化还原电位等，这对于任何一种微生物而言都是极好 的生长条件，所以制作培养基应该尽快配制并立即灭菌，以防止杂菌生长。 一、选用和设计培养基的原则和方法 配制培养基的原则 目的明确：要培养什么微生物？获得何种产物？用于实验室还是发酵生产？ 等等 自养微生物有较强的合成能力，因此，培养这种微生物的培养基由简单无机 物组成。 异养微生物合成能力差，因此培养基中至少需要一种有机物。 实验室的常用培养基：细南：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）： 放线菌：高氏1号合成培养基；酵母菌：麦芽汁培养基：得菌：查氏合成培养基： 如果为了获得菌体，则培养基中的含氮量应当高一些，有利于菌体蛋白的合 成。如果为获得代谢产物，则碳氨比应高一些，是微生物不至于生长过旺，有利 于代谢产物的积紫。 营养协调 微生物只有在营养物质浓度适当、各种营养物质比例适合时才能良好生长。 营养物质浓度过低不能满足生长需要，过高又抑制生长。 碳氮比是直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的积崇的主要因素。碳源不 足的菌体容易早衰。氮源过多，菌体生长过旺，不利于代谢产物的积累。氨源不 足，菌体生长缓慢。 一般细菌和酵母细胞C/N约为5/1，霉菌为10/1，所以霉菌培养基的C/N 较大，适宜在富含淀粉的培养基上生长：细菌酵母培养基要求有较丰富的氨源物 质。如微生物发酵生产谷氨酸需要较多的氨作为合成谷氨酸的氮源，若培养基 CN为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积紫少：若培养基CN为3/1，则菌体生
长受抑制，谷氨酸产量增加。 理化适宜 理化因素指的是培养基的州值、氧化还原电位、渗透压等因素。 pI值 培养基的州必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖 或产生代谢产物.通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5:酵母菌和霉菌：pl4.56 范围内生长。为了维持培养基pH的相对恒定，常在培养基中加pH缓冲剂，这叫 作内源调节。或工业发酵时补加酸、碱。 (2)渗透压及水活度- 渗透压对微生物生长有重要影响。（概念书上）等渗环境适宜微生物生长： 高渗环境会使细胞脱水，发生质壁分离：低渗环境会使细胞吸水膨胀，甚止导致 胞壁脆弱和缺壁细胞（如支原体和原生质体等）破裂。虽然微生物在长期进化中形 成了能适应较大幅度渗透压变化的特性。但培养基中营养物质浓度过高时，会使 渗透压超过微生物的适宜范围，抑制微生物生长。对于某些特殊微生物（如耐盐 微生物)的培养中，需向培养基中加入适量NaC1,提高渗透压。 水活度可以让我们了解微生物细胞中可实际利用的自由水的含量，有利于培 养基的设计。 (3)氧化还原势 各种微生物对培养基的氧化还原电位的要求也不同，好氧微生物的氧化还原 电位要高于厌氧微生物。这一点在大规模发酵中尤为重要。好氧微生物需要专门 的通氧设备，以提高氧化还原电位，厌氧微生物不仅必须去除氧，还应加入还原 剂，如巯基乙醇、半胱氨酸等降低氧化还原电位 经济节约 配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份，特别是在 发酵工业中，以降低生产成本。以粗代精：对微生物来说，各种粗原料营养更加 完全，效果更好。而且在经济上也节约。 以“野”代“家”：以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯 李等都是言含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵。以废代好： 以工农业生产中的废弃物作为培养微生物的原料
以简代繁：以烃代粮：以纤代糖：以氮代朊：以国代进 二、培养基的种类 (一)根据对培养基的成分 1、天然培养基-用各种动物、植物和微生物材料制作的成分含量不完全清 楚且变化不定的营养基质称为天然培养基。该培养基的优点的是取材广泛，营养 丰富，经济简便，微生物生长迅速，适合各种异养微生物生长。缺点是其成分不 完全清楚，成分和含量不确定，用于精细实验时重复性差。仅适用于实验室的 般粗放性实验和工业生产中制作种子和发酵培养基。 一一配制天然培养基的 原料主要有牛肉膏、酵母膏、米曲汁、麦芽汁、蛋白胨、马铃薯、玉米粉、麸 皮及花生饼粉等。 2、合成培养基-用化学试剂配制的营养基质称为合成培养基。该培养基的 特点是化学成分和含量完全清楚且固定不变，适于微生物生长繁殖。其优点是成 分清楚、精确、固定，重现性强，适用于进行营养、代谢、生理生化、遗传育种 及菌种鉴定等精细研究。其缺点是一般微生物在合成培养基上生长缓慢，许多营 养要求复杂的异养型微生物在合成培养基上不能生长。 3、半合成培养基-一用天然有机物提供碳、氨源和生长素，用化学试剂补充 无机盐配制的营养基质称为半合成培养基。该培养基能充分满足微生物的营养要 求，大多数微生物都能在此类培养基上良好生长。 (二)按培养基外观的物理状态来分 1.液体培养基(liquid medium) 不加凝固剂的培养基，营养物质分布均匀，微生物能与营养物质充分接触， 利用适合积累代谢产物。作各种生理、代谢研究和获得大量菌体之用。在生产实 践上，绝大多数发酵培养基都采用液体培养基。 2.固体培养基(solid medium)在液体培养基中加入凝固剂。分为4种类 型. ①周化培养基(solidified medium) 琼脂固体培养基：琼脂又名洋菜，是由红藻门石花菜江葛等藻类地区中提取 的胶体多糖。在一般微生物生长的温度范围内呈周态、透明、粘着力强，经过高 温灭菌也不被破坏。琼脂的化学成分为多聚半乳糖硫酸酯，熔点96℃，凝固点
是40一50℃。琼脂培养基可反复溶化凝固而不改变性质。绝大多数微生物不水 解琼脂。 琼脂：最早用来培养微生物的人工配制的培养基是液体状态的，但是，用液 休培养基分离并获得微生物纯培养非常困难：需将混杂的微生物样品进行系列稀 释，直到平均每个培养管中只有一个微生物个体，进而获得微生物纯培养物。这 种方法不仅繁琐而且重复性差。因此，在早期微生物学研究中，分离微生物的进 展相当缓慢 利用固休培养基分离培养微生物的技术，首先是由德国细菌学家罗伯特及其 助手建立的。1881年，罗伯特发表论文介绍利用土豆片分离微生物的方法。他 用灭菌的刀片将煮熟的士豆切成片，然后用针尖挑取微生物样品在土豆表面划 线，可获得微生物纯培养。但缺点是细菌在土豆上的生长状态很差 几乎在同时，罗伯特的助手发展了利用肉膏蛋白胨培养基培养病原细茵的方 法。因此罗伯特决定采取方法周化这种培养基。他不但是细菌学家还是一个业余 摄影家，具有用明胶制备胶片的经验。于是他受到了启发，用明胶和肉膏蛋白胨 混合后铺在玻璃平板上，让其凝固，然后在其表面接种微生物，获得纯培养。但 由于明胶的溶点低，培养基不能放在37℃（大多数微生物的最适生长温度）培 养，而且容易被某些微生物分解，仍然没有被广泛利用。 有意思的是，罗伯特助手的妻子又丰富的厨房经验，他听说明胶作为凝固剂 出现问题后，便建议用厨房中用来做果冻的琼脂来代替。1882年，琼脂作为凝 固剂开始用于固体培养基的配置。这样，琼脂就从餐桌走向了实验台，为微生物 学的发展起到了重要作用，它是培养基最好的凝固剂。 明胶培养基：由胶原蛋白制得，是最早使用的凝固剂。由于它的凝固点太低， 已被许多微生物分解液化，目前已经很少用了。 硅胶固体培养基：由无机的硅酸钠及硅酸钾被硫酸和盐酸中和时，凝聚而成 的胶体，不含有机物，适合培养自养微生物。 ②非可逆性固化培养基：一且凝周后不能在融化了的培养基。 ③天然固体培养基：用马铃薯块、胡萝卜条等配制的培养基。 ④滤膜(membrane filter)? 3.半固体培养基(semi-solid medium):在液体培养基中加入0.5%左右的
琼脂制成的。 用途：细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察细 菌的运动能力) 噬菌体效价测定（双层平板法》 微生物趋化性的研究 4.脱水培养基：是一种商品培养基，如果培养基含水量高则不好贮存，因此 这种培养基中不含水，在使用时只要加适量的水，灭菌即可。 根据培养基对微生物的功能区分 根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别 培养基。 基础培养基(Minimum Medium) 各种微生物的营养要求虽然都不相同，但大多数微生物所需要的基本营养物 质是一样的。按大多数微生物的营养需要配制一种培养基，称为基本培养基。牛 肉膏蛋白胨培养基就是最常用的基础培养基。它可以作为一些特殊培养基的基础 成分，再根据各种微生物的不同需要加入一、二种特殊成分。如培养某种营养缺 陷型菌株，先配制基本培养基，之后再加入缺陷型菌珠需要的那种营养成分即可。 加富培养基(Enrichment Medium)-一又称增殖培养基。 是在培养基中加入血、血清、动植物组织液或其他营养物质，用来培养要求 较苛刻的某些异养微生物。 利用富集培养基就能从混杂有多种微生物的材料中分离出所需微生物。此培 养基一般是在普通培养基中加入特殊的营养物质，使某种微生物能在其中生长得 比其它微生物更快，以逐渐淘汰掉其它微生物。常用于菌种筛选工作。由于加入 的是特殊的营养物质，通过“投其所好”促进分离对象快速增长，达到选择分离 的目的。 例如：如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的加富 培养基。分离某些病原菌时，也要在培养基中加入血液或动植物组织液：分离碗 杆菌时，在无机培养基中加入硫磺或无机硫化物。 选择性培养基(selected Medium) 利用分离对象对某些化学物质的抗性或生理特长设计的能抑制或限制其它
微生物生长而使分离对象正常生长的营养基质称为选择性培养基。向培养基中加 入抑制剂后，分离对象因对该抑制剂有抗性正常生长繁殖，其它杂菌均被抑制， 即通过“取其所抗”的方法达到选择的目的。 例如：利用以纤维索或石蜡油作为唯一碳源的选择性培养基分离出能分解纤 维素和石蜡油的微生物：利用以蛋白质为唯一氯源的或缺乏氮源的选择性培养基 可以分离到能分解蛋白质或具有固氮能力的微生物。 另一类选择培养基是利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中 加入某种化合物，可以抑制或杀死其它微生物，分离到能抗这种化合物的微生物。 例如：在培养基中加数滴10%的酚，以抑制细菌和霉菌的生长，因而可以从 混杂的微生物群体中分离出放线菌。若在培养基中加入孟加拉红、青霉索、四环 素或链霉素等，可以抑制细菌和放线菌的生长，分离出霉菌和酵母菌」 还可以通过在培养基里加入适量的染料亮绿或结晶紫以抑制革兰氏阳性茵， 分离革兰氏阴性菌。也可以提高培养基中NC1的浓度，从脓液、粪便中分离葡 萄球菌。因为高浓度的盐可以抑制其他大多数细菌的生长。 鉴别培养基 利用微生物代谢产物与指示剂的显色反应快速鉴别不同微生物的营养基质 为鉴别培养基。鉴别培养基中含有能与某一无色代谢产物发生显色反应的指示 剂，使待鉴别微生物菌落产生特定的颜色，以便与外形相似的其它菌落区分开 伊红美兰培养基是最常见的鉴别培养基，用于乳品和饮用水中大肠杆菌等细 菌的检验。伊红和美蓝是两种染料，他们可以抑制革兰氏阳性细菌和一些难以培 养的革兰氏阴性细菌。（桃红色） 将大肠杆菌接种在伊红一美兰培养基上，当大肠杆菌发酵乳糖时，能使伊红 一美兰结合成黑色化合物，所以在这种培养基上长出来的大肠杆菌，呈紫黑色并 带绿色金属光洋的小菌落，而产气杆菌在这种培养基上长出的是较大的棕色菌 落。 其它 除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分析培养基 (assay medium)常用来分析某些化学物质（抗生素、维生素）的浓度，还可用来分 析微生物的营养需求：还原性培养基(reduced medium)专门用来培养厌氧型微生