《基因工程综合实验操作》讲义

基因工程综合实验操作 肠杆菌常规培养 大肠杆菌在LB( Luria- Bertani)液体培养基中,37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固 体培养基中,置于37℃培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素(Amp)抗性 基因质粒(如pUC18)的菌体,则需在培养基中加入100mgml的氨苄青霉素。在重组子克隆的 鉴定培养中,LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(X-gal), 浓度为40mgm,以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG),浓度为50mgml 大肠杆菌染色体DNA的抽提 1.大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时,6000pm,4℃,离心 10分钟收获菌体沉淀。 2.沉淀中加入36 ml buffer a(含溶菌酶5mg/ml),旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟 3.加入400mll0%SDS使最终浓度为1%,混匀,37℃保温30分钟或澄清即可 4.加入10m20mgml的PoK至最终浓度为1mgml,60℃保温60分钟 5.加入1m预先冷冻的5 molL Nacl至最终浓度为1moL,充分混匀后冰浴30分钟 6.4℃,15000mm,离心30min 7.取上清加入等体积(5m)的苯酚饱和溶液,充分混匀后4℃,15000mpm,离心30分钟 8.取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000pm,4℃,离心10分钟 9.取上清加入08V(4ml)异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上,4℃,15000mpm, 离心30分钟 10.弃上清,沉淀用3m170%的冰乙醇洗涤,4℃,15000mpm,离心5分钟。 11.弃上清,沉淀于37℃凉干后,用1 ml ddh2O溶解并移入 Eppendorf管中 2.取5ml电泳 Tris-HCl(pH8.0) EDTA (pH8.0) 20 mM DNA藤切 在 Eppendorf管中建立如下酶切反应体系:置于37℃保温1.5小时,然后电泳检查 质粒DNA 5 ml 限制性内切酶 10×酶切缓冲液1.5ml 无菌重蒸水 总体积 DNA琼脂糖凝胶电泳 1.用1×TAE-bufr配制0.7%的琼脂糖凝胶,在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2.待溶液冷却至60℃左右,加入溴化乙锭(用水配1mg/hml贮存液)至最终浓度为0.5 mg/ml, 充分混匀

基因工程综合实验操作 大肠杆菌常规培养 大肠杆菌在 LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养 12-16 小时。在 LB 固 体培养基中，置于 37℃ 培养箱培养 12-16 小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性 基因质粒（如 pUC18）的菌体，则需在培养 基中加入 100 mg/ml 的氨苄青霉素。在重组子克隆的 鉴定培养中，LB 固体培养基中还要加入特定的生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal）， 浓度为 40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为 50 mg/ml。 大肠杆菌染色体 DNA 的抽提 1. 大肠杆菌传一代后 30ml 液体 LB 培养基以 10%接种量培养 6 小时，6000rpm，4℃，离心 10 分钟收获菌体沉淀。 2. 沉淀中加入 3.6 ml Buffer A（含溶菌酶 5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温 30 分钟。 3. 加入 400 ml 10% SDS 使最终浓度为 1%，混匀，37℃保温 30 分钟或澄清即可。 4. 加入 10 ml 20 mg/ml 的 ProK 至最终浓度为 1 mg/ml，60℃保温 60 分钟。 5. 加入 1 ml 预先冷冻的 5 mol/L NaCl 至最终浓度为 1 mol/L，充分混匀后冰浴 30 分钟。 6. 4℃，15 000 rpm，离心 30min。 7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后 4℃，15000 rpm，离心 30 分钟。 8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后 13000 rpm，4℃，离心 10 分钟。 9. 取上清加入 0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后 -20℃放置 30 分钟以上，4℃，15000 rpm， 离心 30 分钟。 10. 弃上清，沉淀用 3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心 5 分钟。 11. 弃上清，沉淀于 37℃凉干后，用 1 ml ddH2O 溶解并移入 Eppendorf 管中。 12. 取 5 ml 电泳。 Buffer A Tris-HCl (pH8.0) 10 mM EDTA (pH8.0) 20 mM DNA 酶切 在 Eppendorf 管中建立如下酶切反应体系：置于 37℃保温 1.5 小时，然后电泳检查 质粒 DNA 5 ml 限制性内切酶 1 ml 10×酶切缓冲液 1.5 ml 无菌重蒸水 8.5 ml 总体积 15 ml DNA 琼脂糖凝胶电泳 1. 用 1×TAE–buffer 配制 0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 2. 待溶液冷却至 60℃左右，加入溴化乙锭（用水配 1 mg/ml 贮存液）至最终浓度为 0.5 mg/ml， 充分混匀

用透明胶封固玻璃板两头,在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子,将温热的琼脂糖凝 胶倒入胶模中,凝胶厚度 在3-5mm之间 4.在凝胶完全凝固后,撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1×TAE- buffer的电泳槽中, 轻轻地拔去梳子,且使 缓冲液没过胶面约1mm 5.DNA样品与溴酚蓝混合后,用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中, 6.盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极(红线)移动。采用100V电压进行电泳 7.当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后(约半小时),切断电流,取出玻璃板,在紫外灯下观 查凝胶 50× TAE-buffer 242 冰醋酸 57.1ml EDTA 04g DIG分子杂交 I.DNA转移和固定 1.大肠杆菌染色体DNA(各1-2mg)分别用 BamHI、 EcoRI、Pst、 HindIII酶切,电泳 2.电泳拍照(胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位),搭建转移台,在盛有0.4 N NaOh 的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜(剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块)、凝胶 尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物,放置过夜。注:在摆放过程中要防止气泡的产生 3.次日取出尼龙膜,在槽口处用圆珠笔标记后,在6×SSC中洗涤306,放于牛皮纸上 于80℃烘2h,放入保鲜膜内于-20℃存放或立即杂交。 oligonucleo 1.用无菌水溶解 oligonucleotide至适当浓度 2.在插入冰中的管中混合 oligonucleotide 反应缓冲液(vall) CoCl2溶液(vial2) DIG-dUTP溶液(via3)1ml dATP溶液(via4) TdT (50units)(vial 5) I ml 加无菌水至终体积20ml 3.37℃保温15min,然后置于冰中,加入2m糖原溶液( I ml vial9+200ml02 MEDTA, 4.终止标记反应后,加入25m4 M LiCI,75ml乙醇(-20℃预冷),沉淀 oligonucleotide 5.至少在70℃放置30分钟或20℃放置2h,15000转/分离心20min。 6.沉淀用50m70%乙醇洗涤、晾干,用适当体积的无菌水溶解,保存于-20℃ I.预杂交和杂交

3. 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板 0.5-1.0 mm 的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝 胶倒入胶模中，凝胶厚度 在 3-5 mm 之间。 4. 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有 1×TAE-buffer 的电泳槽中， 轻轻地拔去梳子，且使 缓冲液没过胶面约 1 mm。 5. DNA 样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。 6. 盖上电泳槽并通电，使 DNA 向阳极（红线）移动。采用 100V 电压进行电泳。 7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观 查凝胶。 50×TAE-buffer Tris 242 g/l 冰醋酸 57.1 ml/l EDTA 0.4 g/l DIG 分子杂交 I．DNA 转移和固定 1. 大肠杆菌染色体 DNA（各 1-2 mg）分别用 BamHI、EcoRI、PstI、HindIII 酶切，电泳。 2. 电泳拍照（胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位），搭建转移台，在盛有 0.4N NaOH 的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜（剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块）、凝胶、 尼龙薄膜和卷筒纸及 500 克重物，放置 过夜。注：在摆放过程中要防止气泡的产生 3. 次日取出尼龙膜，在槽口处用圆珠笔标记后，在 6×SSC 中洗涤 30s，放于牛皮纸上， 于 80℃烘 2h，放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。 II．oligonucleotide tailing 1. 用无菌水溶解 oligonucleotide 至适当浓度。 2. 在插入冰中的管中混合： oligonucleotide 100pmol 反应缓冲液（vial 1） 4 ml CoCl2 溶液（vial 2） 4 ml DIG-dUTP 溶液（vial 3） 1 ml dATP 溶液（vial 4） 1 ml TdT（50units）（vial 5） 1 ml 加无菌水至终体积 20 ml。 3. 37℃保温 15min，然后置于冰中，加入 2 ml 糖原溶液（1 ml vial 9 + 200 ml 0.2M EDTA， pH8.0）。 4. 终止标记反应后，加入 2.5 ml 4M LiCl，75 ml 乙醇（-20℃预冷），沉淀 oligonucleotide。 5. 至少在-70℃放置 30 分钟或-20℃放置 2h，15000 转/分离心 20min。 6. 沉淀用 50 ml 70%乙醇洗涤、晾干，用适当体积的无菌水溶解，保存于-20℃。 III．预杂交和杂交

1.把尼龙膜放入杂交管中,按20m/100cm2加入预杂交液,于杂交炉中68℃保温至少 2.将DlG标记的DNA探针(5~25ng/m)煮沸10min,迅速插入盐冰中变性 3.弃此预杂交液,按25m00cm2膜加入含5-25ng/ml标记探针的杂交液 4.膜在杂交温度保温6-16hr。 5.在杂交温度洗涤: a至少50m00cm22×SSC,SDS,0.1%(W/) 5min2次 b0.1×SsC,SDS,0.1%(w/) 5min2次 6.膜可立即检测或晾干后保存。 免疫检测 1.杂交后严格洗涤,把膜直接浸入 Washing buffer中1-5mn。 2.在100 ml Blocking solution(1×conc)放置30min 3.用 Blocking Solution(1×Conc把anti-DG- AP conjugate稀释至50mUm,50ml中 有l0 ml anti-DIG-AP 4.膜在50m抗体溶液中放置30min。 5.100 ml Washing buffer洗膜l5min×2次 6.膜在20 ml Detection buffer中平衡2-5min 7.膜在新配的10 ml color- substrate solution中放置5min(置于黑暗中),注意在显色过 程中不要摇动 8.几分钟后有色物质开始生成,反应一般在1 9.颜色达到一定强度后,可用50mlH2O洗膜5min来终止反应 10.结果拍照保留 20×SSC 3 mol/ 0.3 mol/ pH7.0 Buffer 1 Maleic acid 0.1 mol/ Nacl 0.15mopH7.5固体NaOH调节 10× Blocking 溶于 Buffer I,灭菌后存于4℃ 杂交 Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交 使用前加入 polyA(val1l) N-lauroylsarkosine 终浓度为0.lmg/h 0.02% 2×预杂交液 用于DNA片段探针的杂交 2XSSC 使用时加入SDS,终浓度为0.5% Denhardts试剂 鮭鱼精子DNA碎片

1. 把尼龙膜放入杂交管中，按 20 ml/100 cm2 加入预杂交液，于杂交炉中 68℃保温至少 1 h。 2. 将 DIG 标记的 DNA 探针（5~25ng/ml）煮沸 10 min，迅速插入盐冰中变性。 3. 弃此预杂交液，按 2.5 ml/100 cm2 膜加入含 5-25 ng/ml 标记探针的杂交液。 4. 膜在杂交温度保温 6-16 hr。 5. 在杂交温度洗涤： a 至少 50 ml/100 cm2 2×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2 次 b 0.1×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2 次 6. 膜可立即检测或晾干后保存。 IV. 免疫检测 1. 杂交后严格洗涤，把膜直接浸入 Washing buffer 中 1-5 min。 2. 在 100 ml Blocking solution（1×conc）放置 30 min。 3. 用 Blocking Solution（1×Conc 把 anti-DIG-AP conjugate 稀释至 150 mU/ml，50 ml 中 有 10ml anti-DIG-AP conjugate）。 4. 膜在 50 ml 抗体溶液中放置 30 min。 5. 100ml Washing buffer 洗膜 15 min×2 次。 6. 膜在 20 ml Detection buffer 中平衡 2-5 min。 7. 膜在新配的 10 ml Color-substrate solution 中放置 5 min（置于黑暗中），注意在显色过 程中不要摇动。 8. 几分钟后有色物质开始生成，反应一般在 16 h 后达到完全。 9. 颜色达到一定强度后，可用 50 ml H2O 洗膜 5 min 来终止反应。 10. 结果拍照保留。 20×SSC NaCl 3 mol/l Na-citrate 0.3 mol/l pH 7.0 Buffer 1 Maleic acid 0.1 mol/l NaCl 0.15 mol/l pH 7.5 用固体 NaOH 调节 10×Blocking Blocking reagent 10% 溶于 Buffer 1，灭菌后存于 4℃ 杂交 Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交 5×SSC Blocking reagent 1% 使用前加入 polyA（vial 11） N-lauroylsarkosine 0.1% 终浓度为 0.1mg/ml SDS 0.02% 2×预杂交液 用于 DNA 片段探针的杂交 12×SSC 使用时加入 SDS，终浓度为 0.5% 10×Denhardts 试剂 鲑鱼精子 DNA 碎片 200 mg/ml

Tween 20 0.3% 加入Buer1中 Detection buffer Tris-HCI 显色中每10ml加入200u NaCl 0.1 mol/ NBT/BCIP stock solution MgCl2 50 mmol/ PCR法体外扩增phoA(碱性磷酸单脂基因) 1.按如下体积加入各反应物 体积 ddH20 20.5ml Mg2+(2.5mM) 5 ml d NTP (2. 5mM) Primer (10 pmol/mD) 染色体DNA(约100ng/ml) 5 ml ac酶(sUml) 0.5ml 2.充分混匀后按下列条件进行反应 97℃5min 95℃ 57℃1min30个循环 72℃2 72℃10min 3.取50%采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况,扩增产物集中于1.5kb片段的位置附近,割下 该位置的凝胶进行外源DNA的回收。 4.回收的PCR扩增产物直接与pMDl8-T载体连接,连接反应如下 PMD I8-T PCR产物 ∑ 5ml 5.16℃连接1h以上,用于转化。 DNA的琼脂糖凝胶回收 用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于 Eppendorf 管中,加入100ml重蒸水 2.用牙签将凝胶块尽量捣碎,剪去管的上部,用烧红的针头在管底扎几个微孔,孔径 越细越好

Washing Buffer Tween 20 0.3% 加入 Buffer 1 中 Detection buffer Tris-HCl 0.1 mol/l 显色中每 10ml 加入 200µl NaCl 0.1 mol/l NBT/BCIP stock solution MgCl2 50 mmol/l pH 9.5 PCR 法体外扩增 phoA（碱性磷酸单脂酶基因） 1. 按如下体积加入各反应物： 总体积 50 ml ddH2O 20.5 ml 10×buffer 5 ml Mg2+（2.5mM） 5 ml dNTP（2.5mM） 4 ml Primer1（10 pmol/ml） 10 ml Primer2（10 pmol/ml） 10 ml 染色体 DNA（约 100 ng/ml） 5 ml Taq 酶（5 U/ml） 0.5 ml 2. 充分混匀后按下列条件进行反应： 97℃ 5 min 95℃ 30 s 57℃ 1 min 30 个循环 72℃ 2 min 72℃ 10 min 4℃ ∞ 3. 取 50％采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况，扩增产物集中于 1.5 kb 片段的位置附近，割下 该位置的凝胶进行 外源 DNA 的回收。 4. 回收的 PCR 扩增产物直接与 pMD18-T 载体连接，连接反应如下： Solution I PMD18-T PCR 产物 ∑ 5 ml 1 ml 4 ml 10 ml 5. 16℃连接 1h 以上，用于转化。 DNA 的琼脂糖凝胶回收 1. 用手术刀在 DNA 紫外检测仪下切割下含有所要 DNA 片段的凝胶块置于 Eppendorf 管中，加入 100 ml 重蒸水。 2. 用牙签将凝胶块尽量捣碎，剪去管的上部，用烧红的针头在管底扎几个微孔，孔径 越细越好

将管套入另一个 Eppendorf管中,常温下,15000rpm离心10分钟。 4.将上清液吸到收集管中,向沉淀中加入100ml重蒸水。 重复步骤(2)、(3)、(4)各一次,见图 6.收集的上清液加入0.V的KAc(PH55,3M)和20-25V的无水乙醇,充分混匀 后20℃放置30min,取 出15000rpm,4℃离心30mi 7.弃上清,加入400m70%的乙醇,15000pm,4℃离心5min。 8.弃上清,沉淀凉干后用20 ml ddh2O溶解待用 大肠杆菌感受态细胞的制备 1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上,37℃下隔夜培养。 2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中,37℃C下隔夜培养。 3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mLB培养基 4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时,OD600接近0.5 5.4℃,6000mpm离心10分钟收获菌体 6.上述得到的菌体沉淀用10m的10 mmol/L cacl2(冰冻)悬浮,4℃,6000mpm离心 10分钟。 7.弃上清,将沉淀用1ml的7 mmo l CaC(冰冻)重新悬浮并转入无菌 Eppendorf管 8.冰水浴中放置8h即可使用。 大肠杆菌的转化 1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。 2.吸取90m感受态细胞悬浮液至无菌 Eppendorf管中,加入10mDNA溶液,轻轻混匀, 在冰水浴中放置30分钟 3.42℃水浴中脉冲2分钟,快速转移至冰水浴中,加入900mLB培养基,37℃水浴摇床 培养1-1.5小时 4.吸取100ml已转化的感受态细胞涂布于100mg/mAp和40mg/mlx-gal的LB平板上。 5.37℃下倒置培养12-16小时,挑选单菌落划线扩增培养。 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA 1.在 Eppendorf管中加入110m的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/hml)溶液 挑入米粒大小的菌团,充 分悬浮并混匀 2.上述菌体悬浮液沸水煮30秒 3.迅速放置于常温下15000pm离心15分钟。 4.用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇,充分混匀后4℃ 15000rpm离心20分钟。 5.弃上清液,加入70%冰乙醇400ml,4℃,15000mpm离心5分钟

3. 将管套入另一个 Eppendorf 管中，常温下，15000 rpm 离心 10 分钟。 4. 将上清液吸到收集管中，向沉淀中加入 100 ml 重蒸水。 5. 重复步骤(2)、(3)、(4)各一次，见图。 6. 收集的上清液加入 0.1V 的 KAc（PH5.5，3M）和 2.0-2.5 V 的无水乙醇，充分混匀 后-20℃放置 30 min，取 出 15000 rpm，4℃离心 30 min。 7. 弃上清，加入 400 ml 70％的乙醇，15000rpm，4℃离心 5 min。 8. 弃上清，沉淀凉干后用 20 ml ddH2O 溶解待用。 大肠杆菌感受态细胞的制备 1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于 LB 固体培养基上，37℃下隔夜培养。 2. 挑取单菌落接种于 30 ml LB 液体培养基中，37℃下隔夜培养。 3. 按 1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于 30 ml LB 培养基中。 4. 在 37℃的水浴摇床中培养 1.5 小时，OD600 接近 0.5。 5. 4℃，6000 rpm 离心 10 分钟收获菌体。 6. 上述得到的菌体沉淀用 10 ml 的 10 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，4℃，6000 rpm 离心 10 分钟。 7. 弃上清，将沉淀用 1 ml 的 75 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮并转入无菌 Eppendorf 管 中。 8. 冰水浴中放置 8 h 即可使用。 大肠杆菌的转化 1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。 2. 吸取 90 ml 感受态细胞悬浮液至无菌 Eppendorf 管中，加入 10 ml DNA 溶液，轻轻混匀， 在冰水浴中放置 30 分钟。 3. 42℃水浴中脉冲 2 分钟，快速转移至冰水浴中，加入 900 ml LB 培养基，37℃水浴摇床 培养 1-1.5 小时。 4. 吸取 100 ml 已转化的感受态细胞涂布于 100 mg/ml Ap 和 40 mg/ml X-gal 的 LB 平板上。 5. 37℃下倒置培养 12-16 小时，挑选单菌落划线扩增培养。 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒 DNA 1. 在 Eppendorf 管中加入 110 ml 的 STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为 5 mg/ml）溶液， 挑入米粒大小的菌团，充 分悬浮并混匀。 2. 上述菌体悬浮液沸水煮 30 秒。 3. 迅速放置于常温下 15000 rpm 离心 15 分钟。 4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入 100 ml 的异丙醇，充分混匀后 4℃， 15000 rpm 离心 20 分钟。 5. 弃上清液，加入 70%冰乙醇 400 ml，4℃，15000 rpm 离心 5 分钟

6.沉淀凉干后用50m无菌重蒸水溶解。 7.取5m电泳检测 STET: 蔗糖 TritonX-100 Tris-HCI(PH8.0) 50 mM EDTA(PH8.0) 50 mM 碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA 1.15m培养物6000pm,4℃离心10分钟,弃去上清液 2.加入100m溶液Ⅰ悬浮菌体,室温放置5分钟。 3.加入200ml溶液Ⅱ,立即轻轻混匀,室温放置至溶液几乎澄清。 4.加入150ml溶液Ⅲ,轻轻混匀,冰浴30分钟。 5.4℃,15000mpm离心20分钟,收集上清液 6.上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液(400ml)氯仿,充分混匀,4℃,15000pm离心 20分钟,将上清液转移至另一离心管。 7.在上清液中加入400m氯仿溶液,混匀,10000pm离心10分钟,将上清液转移至另 离心管 8.在上清液中加入400m异丙醇,-20℃放置30分钟,4℃,15000pm离心20分钟 9.用400ml75%的冰乙醇洗涤一次,凉干 10.加入50m无菌重蒸水溶解质粒DNA。 11.取2m作酶切电泳检查。 溶液I D-Glucose Tris-HCl(pH 8.0) 50 mmol/L EDTA (pH 10 mmol/L 121℃消毒20分钟,使用时加入溶菌酶,终浓为5mg/ml 溶液Ⅱ SDS 0.2 mol/L KAc(pH5.5) 3 mol/L 工程菌发 1.挑取少量 pETI la-phoA/BL2l(DE3)菌体接种于含Ap(终浓度100mg/m)的30mlLB 液体培养基中,于37℃培养过夜:以相同条件接种 pELla/BL2l(DE3)为对照 2.以1%的接种量将上述一级培养物接种于含Ap(终浓度100mg/ml)的100mlLB液体 培养基中,恒温培养2h后(OD600约为0.5),加入诱导剂IPIG终浓度1mM,继续37℃培养

6. 沉淀凉干后用 50 ml 无菌重蒸水溶解。 7. 取 5 ml 电泳检测。 STET： 蔗糖 8％ TritonX-100 5％ Tris-HCl (PH8.0) 50 mM EDTA (PH8.0) 50 mM 碱溶法制备大肠杆菌质粒 DNA 1. 1.5 ml 培养物 6000 rpm，4℃离心 10 分钟，弃去上清液。 2. 加入 100 ml 溶液 I 悬浮菌体，室温放置 5 分钟。 3. 加入 200 ml 溶液 II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。 4. 加入 150 ml 溶液 III，轻轻混匀，冰浴 30 分钟。 5. 4℃，15000 rpm 离心 20 分钟，收集上清液。 6. 上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400 ml）氯仿，充分混匀，4℃，15000 rpm 离心 20 分钟，将上清液转移 至另一离心管。 7. 在上清液中加入 400 ml 氯仿溶液，混匀，10000 rpm 离心 10 分钟，将上清液转移至另 一离心管。 8. 在上清液中加入 400 ml 异丙醇，–20℃放置 30 分钟，4℃，15000 rpm 离心 20 分钟。 9. 用 400 ml 75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。 10. 加入 50 ml 无菌重蒸水溶解质粒 DNA。 11. 取 2 ml 作酶切电泳检查。 溶液 I D-Glucose 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0） 50 mmol/L EDTA（pH 8.0） 10 mmol/L 121℃消毒 20 分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为 5 mg/ml 溶液 II SDS 1% NaOH 0.2 mol/L 溶液 III KAc（pH5.5） 3 mol/L 工程菌发酵 1. 挑取少量 pET11a-phoA/BL21(DE3)菌体接种于含 Ap（终浓度 100 mg/ml）的 30ml LB 液体培养基中，于 37℃培养过夜；以相同条件接种 pET11a/BL21(DE3)为对照。 2. 以 1%的接种量将上述一级培养物接种于含 Ap（终浓度 100 mg/ml）的 100 ml LB 液体 培养基中，恒温培养 2h 后 （OD600 约为 0.5），加入诱导剂 IPTG 终浓度 1 mM，继续 37℃培养

3.诱导后培养3h后收集菌体,4℃,6000pm离心l0min,弃上清液,菌体沉淀置于-20℃ 保存待用。 细胞裂解 1.以5ml碳酸钠-碳酸氢钠重新悬浮菌体沉淀,冰浴超声裂解细胞。 2.超声波裂解液于4℃,15000pm离心30min,取上清液待用 碳酸钠-碳酸氢钠溶液(0.M,PH10.0) Na2C03 NaHCO3 0.84% 碱性磷酸单酯酶的活力测定 1.以下列体系进行酶活测定的反应 反应体系 Buffer 酶液 NaoH(0.5M) 1.2-X 2.底物NPP加入 Buffer(碳酸钠-碳酸氢钠溶液)后,底物与酶分别于37℃预热3-5min 然后混合37℃保温30min,加入NaOH终止反应 3.参比管预热后先加入NaOH再加入酶保温。 4.上述测活反应液与405m测定吸收值 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.安装玻璃板并确定所需凝胶溶液体积。 2.迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液约45ml,并于其上覆盖一层水。 3.分离胶聚合完全后(约20min),傾出覆盖液体 4.在分离胶上层直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入梳子,避免产生气泡。 5.用 Loading buffer处理样品菌体,在100℃加热5min左右,使蛋白质变性 6.浓缩胶聚合后小心移出梳子,用无菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胶后,按顺 序加样 7.接通电泳装置,凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后,电压提高到15 V/cm,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。 卸下玻璃板,标记凝胶加样方位,用考马斯亮蓝染色液( Staining Buffer)对凝胶进行 染色,至少1h以上 9.移出凝胶,回收染色液,用 Destain ing buffer进行脱色1-2小时,其间应更换脱色液三 10.凝胶保存于水中,或把凝胶干燥成胶片保存 5×SDS- PAGE Buffer SDS-PAGE电泳缓冲液,用时稀释5倍 T I gl 甘氨酸 SDS(10%) SDS-PAGE 分离胶(10m) 浓缩胶(5m)

3. 诱导后培养 3h 后收集菌体，4℃，6000rpm 离心 10 min，弃上清液，菌体沉淀置于-20℃ 保存待用。 细胞裂解 1. 以 5 ml 碳酸钠-碳酸氢钠重新悬浮菌体沉淀，冰浴超声裂解细胞。 2. 超声波裂解液于 4℃，15000 rpm 离心 30 min，取上清液待用。 碳酸钠-碳酸氢钠溶液（0.1M，PH10.0） Na2CO3 1.06% NaHCO3 0.84％ 碱性磷酸单酯酶的活力测定 1. 以下列体系进行酶活测定的反应： 反应体系 NPP Buffer 酶液 NaOH（0.5M） 3.0 ml 0.6 ml 1.2-X X 1.2 2. 底物 NPP 加入 Buffer（碳酸钠-碳酸氢钠溶液）后，底物与酶分别于 37℃预热 3-5 min， 然后混合 37℃保温 30 min， 加入 NaOH 终止反应。 3. 参比管预热后先加入 NaOH 再加入酶保温。 4. 上述测活反应液与 405 nm 测定吸收值。 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 安装玻璃板并确定所需凝胶溶液体积。 2. 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液约 4.5 ml，并于其上覆盖一层水。 3. 分离胶聚合完全后（约 20 min），倾出覆盖液体。 4. 在分离胶上层直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入梳子，避免产生气泡。 5. 用 Loading Buffer 处理样品菌体，在 100℃加热 5 min 左右，使蛋白质变性。 6. 浓缩胶聚合后小心移出梳子，用无菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胶后，按顺 序加样。 7. 接通电泳装置，凝胶上所加电压为 8 V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到 15 V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。 8. 卸下玻璃板，标记凝胶加样方位，用考马斯亮蓝染色液（Staining Buffer）对凝胶进行 染色，至少 1 h 以上。 9. 移出凝胶，回收染色液，用 Destaining Buffer 进行脱色 1-2 小时，其间应更换脱色液三 四次。 10. 凝胶保存于水中，或把凝胶干燥成胶片保存。 5×SDS-PAGE Buffer SDS-PAGE 电泳缓冲液，用时稀释 5 倍 Tris 15.1 g/l 甘氨酸 94 g/l SDS（10%） 50 ml/l SDS-PAGE 分离胶（10ml） 浓缩胶（5 ml）

H20 Acryl-bis (3.3c) 3.6ml 0.91ml Tris-HCI 25ml(1.5M,pH8.8) 063ml(1.0M,pH68) SDS(10%) 0.05 过硫酸铵(10%) 0.1 ml 0.05ml TEMED 2× Loading buffer Tris-HCI 4% 溴酚蓝 SDS-PAGE Staining Buffer Destaining Buffer 乙酸 水 考马斯亮蓝 0.25-0.5% 碱性磷酸单酯酶提取 试剂 0 mmol/L Tris-HCI (pH7.0) moM/L Tris-HCI 实验步骤: 将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000rpm离心15min,收集菌体 2.将收集的菌体以10mlg湿菌体的比例,用50 mmol/L Tris-HCl(pH70)悬浮,再用超 声波破膜 3.菌裂解液于4℃,15000mpm离心20min,取上清液 4.上清液加入NaC至终浓度为0.8moL,70℃水浴30min,12000rpm离心10min 丢弃沉淀: 5.上清液于0℃边搅拌边加入固体硫酸铵至60%饱和度,静置2-4h,12000rpm离心 20min,弃上清液。 沉淀用1/0体积的pH7605 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解,于4℃对相同缓冲液透折。直至 透析袋内外平衡。透析好的样品进行离子交换柱层析。 包涵体中碱性磷酸单酯提取

H2O 3.7 ml 3.3 ml Acryl-bis（3.3c） 3.6 ml 0.91 ml Tris-HCl 2.5 ml（1.5M，pH8.8） 0.63 ml（1.0M，pH6.8） SDS（10%） 0.1 ml 0.05 ml 过硫酸铵（10%） 0.1 ml 0.05 ml TEMED 4 ml 5 ml 2×Loading Buffer Tris-HCl 100 mM SDS 4% 溴酚蓝 0.2% 甘油 20% SDS-PAGE Staining Buffer Destaining Buffer 乙醇 30% 30% 乙酸 10% 10% 水 60% 60% 考马斯亮蓝 0.25-0.5% 碱性磷酸单酯酶提取 试剂： 50 mmol／L Tris-HCl (pH7.0) pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 实验步骤： 1. 将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以 5000 rpm 离心 15min，收集菌体； 2. 将收集的菌体以 10 mL/g 湿菌体的比例，用 50 mmol/L Tris-HCl (pH7.0)悬浮，再用超 声波破膜； 3. 菌裂解液于 4℃，15000 rpm 离心 20 min，取上清液。 4. 上清液加入 NaCl 至终浓度为 0.8 mol/L，70℃水浴 30min，12000 rpm 离心 10 min， 丢弃沉淀； 5. 上清液于 0℃边搅拌边加入固体硫酸铵至 60％饱和度，静置 2-4 h ，12000 rpm 离心 20 min，弃上清液。 沉淀用 1/10 体积的 pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液溶解，于 4℃对相同缓冲液透折。直至 透析袋内外平衡。 透析好的样品进行离子交换柱层析。 包涵体中碱性磷酸单酯酶提取

试剂 50 mmol Tris-HCl pH8.0 3 mol/L BK(.1 mol/Tris-HCl pH8.0) T缓冲液 05mmoL氧化型谷胱甘肽 4mmoL还原型谷胱甘肽溶液 实验步骤 1.将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000pm离心15min,收集菌体 2.约每克湿菌加3m的量悬浮于50 mmol/L Tris-HCI PH!.0,含1 mmol/L EDTA的缓 冲液中进行超声破碎 3.超声破菌后1200mpm,4℃离心3omin进行固液分离,用T缓冲液反复洗涤除去可 溶性杂蛋白,核酸及外加溶质等: 4.用9倍量的变性剂3moL脲(0.1mol/ Tris-HCI pH8.0)和0.5%tonx-100的TE 缓冲液分别洗涤 5.将包涵体溶于变性液50 mmolL Tris-HCI,1 mmoL/LLED TA,8 mmol/L脲(pH8.0), 12000rpm离心30min 6.取上清液,在0.25mmol/L氧化型谷胱甘肽和2mmol几L还原型谷胱甘肽溶液中,4℃ 透析过夜:透析液浓缩备用。临用前加相应缓冲液至一定体积 高子交换柱层析纯化碱性磷酸单酯藤 试剂 EAE纤维素32 0.02moL对硝基酚磷酸二钠 pH760 MRis-HCl缓冲液 pH760 MTris-HCI(内含0.3NNaC1)缓冲液 pH0.00.1MNa2CO3- NahCo3的底物缓冲液 实验步 I.DEAE纤维素预处理 1.称取5克DE-32,于小烧杯中,加入75毫升0.5 molL HCI的烧杯中,于室温轻轻搅拌 30分钟。 2.将糊状物移入布氏漏斗中,用蒸馏水淋洗并浸泡5分钟,不时轻轻搅拌,抽滤。如此重 复,每加一次去离子水,浸泡一段时间,再进行抽滤,至洗涤液pH等于4 3.将糊状物移入烧杯中,加入75毫升0.5 mol/L NaoH,于室温轻轻搅拌30分钟后,将交 换剂移入布氏漏斗中,反复用去离子水淋洗、抽滤,直至洗涤液pH为8,抽干 4.将DEAE纤维素移入烧杯中,浸泡在150毫升去离子水中。用0.5 molL HCl把p调 至76左右(可在pH计上进行或用p试纸调试),须使悬液最终p在10分钟内无变化,然后 抽滤 5.将上述滤块置于100毫升烧杯中,加入75毫升pH760.5 mol/ Tris-HCI缓冲液轻轻搅

试剂： 50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 3 mol/L 脲（0.1 mol/Tris-HCl pH8.0） TE 缓冲液 0.5 mmol/L 氧化型谷胱甘肽 4 mmol/L 还原型谷胱甘肽溶液 实验步骤： 1. 将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以 5000 rpm 离心 15 min，收集菌体； 2. 约每克湿菌加 3 ml 的量悬浮于 50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，含 1 mmol/L EDTA 的缓 冲液中进行超声破碎； 3. 超声破菌后 1200 rpm，4℃离心 30min 进行固液分离，用 TE 缓冲液反复洗涤除去可 溶性杂蛋白，核酸及外加溶质等； 4. 用 9 倍量的变性剂 3 mol/L 脲（0.1 mol/Tris-HCl pH8.0）和 0.5%Trton X-100 的 TE 缓冲液分别洗涤； 5. 将包涵体溶于变性液 50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/LLEDTA，8 mmol/L 脲（pH 8.0）， 12000 rpm 离心 30min； 6. 取上清液，在 0.25 mmol/L 氧化型谷胱甘肽和 2 mmol/L 还原型谷胱甘肽溶液中，4℃ 透析过夜； 透析液浓缩备用。临用前加相应缓冲液至一定体积。 离子交换柱层析纯化碱性磷酸单酯酶 试剂 DEAE-纤维素 32 0.02 mol/L 对硝基酚磷酸二钠 pH 7.6 0.5M Tris-HCl 缓冲液 pH7.6 0.5M Tris-HCl（内含 0.3 N NaCl）缓冲液 pH10.0 0.1M Na2CO3-NaHCO3 的底物缓冲液 实验步骤： I．DEAE-纤维素预处理 1. 称取 5 克 DE-32，于小烧杯中，加入 75 毫升 0.5 mol/L HCl 的烧杯中，于室温轻轻搅拌 30 分钟。 2. 将糊状物移入布氏漏斗中，用蒸馏水淋洗并浸泡 5 分钟，不时轻轻搅拌，抽滤。如此重 复，每加一次去离子水， 浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液 pH 等于 4。 3. 将糊状物移入烧杯中，加入 75 毫升 0.5 mol/L NaOH，于室温轻轻搅拌 30 分钟后，将交 换剂移入布氏漏斗中，反 复用去离子水淋洗、抽滤，直至洗涤液 pH 为 8，抽干。 4. 将 DEAE-纤维素移入烧杯中，浸泡在 150 毫升去离子水中。用 0.5 mol/L HCl 把 pH 调 至 7.6 左右（可在 pH 计上进行 或用 pH 试纸调试），须使悬液最终 pH 在 10 分钟内无变化，然后 抽滤。 5. 将上述滤块置于 100 毫升烧杯中，加入 75 毫升 pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液轻轻搅

拌之后,静置20分钟,用倾斜法除去上清液中细微粒子,如此重复若干次,最后上清液pH值与 缓冲液几乎一致 6.将含有1倍体积pH7.60.5 mol/L tris-HCl缓冲液的DEAE-纤维素浆液含放在抽滤瓶中 减压除尽气泡。备用 Ⅱl.装柱 1.层析柱(1.0×20cm)清洗后,用去离子水洗涤一遍。柱的下端联接好流出液引导塑料 管,塑料管末端接上小乳胶管,在乳胶管上装上螺旋夹 2.关紧螺旋夹。柱内装入适量的pH760.5 M Tris-HCl缓冲液,微开螺旋夹。让缓冲液缓 慢流出,赶走层析柱的流出液引导塑料管内的气泡,柱中仍保留少量缓冲液,关紧螺旋夹 3.将减压除尽气泡的DEAE纤维素浆液沿层析柱管壁倒人柱中,使凝胶树脂在柱中保留 的缓冲液中自然沉降,待凝胶树脂沉降至离层析柱柱床高约cm高度时,部分旋松螺旋夹,让柱 内溶液缓慢流岀,注意此时的流速要极其慢。再继续加入DEAE-纤维素浆液,直至凝胶树脂自然 沉降后高达10cm以上的柱床体积。缓冲液液面比凝胶树脂层面高1cm左右 I.平衡 当装柱完毕后,用pH1760.5 mol/L Tris-HCl缓冲液上柱继续进行平衡,流速维持在1毫升/5 分钟(大约4-5滴分),直至流出液的pH值与上柱缓冲液完全相同 层析 1.关紧螺旋夹,用毛细吸管小心吸去凝胶树脂层面上的缓冲液至凝胶树脂层面与缓冲液液 面齐 2.用吸管吸取实验一或实验二中提取的碱性磷酸单酯酶的粗酶溶液,小心沿柱壁缓缓加入 柱内。轻开螺旋夹,使 柱中缓冲液缓缓流出,让粗酶溶液进入纤维素凝胶树脂内,至与凝胶树脂层面齐平时 3.柱壁用少量pH760.5 mol/L Tris-HCI缓冲液小心洗涤2-3次,重复至使缓冲液液面与凝 胶树脂层面齐平 4.然后加λpH760.5 molL tris-HCl缓冲液,使缓冲液液面比凝胶树脂层面高1-2cm左 右,保持流速1毫升/5分钟(大约4-5滴/分) V.洗脱 1.将梯度洗脱仪和层析柱连接好。 2.在梯度洗脱仪中的A(混合器)中加入100mlpH760.5MTis-HCl缓冲液,在梯度洗 脱仪中的B(贮存器)内 加入100mlpH760.5 M Tris-HCI(内含0.3NNaC1)缓冲液。注意使A(混合器)和B(贮 存器)内的液面应处 于同一水平面,同时应排除连接管内的气泡。 3.开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关,调节搅拌速度,以A混合器内缓冲液旋转而无 明显旋涡为宜 4.打开梯度洗脱仪与层析柱的连接管道,依序打开A(混合器)和B(贮存器),开始对 层析柱进行梯度洗脱。保持流速2毫升/5分钟(大约3滴/分),收集洗脱流出液,收集管速为:管 5分钟,收集各管依次测定OD280值并定性测酶活 ⅥI.酶活的定性测定

拌之后，静置 20 分钟，用倾 斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液 pH 值与 缓冲液几乎一致。 6. 将含有 1 倍体积 pH 7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液的 DEAE-纤维素浆液含放在抽滤瓶中 减压除尽气泡。备用。 II. 装柱 1. 层析柱（1.0×20cm）清洗后，用去离子水洗涤一遍。柱的下端联接好流出液引导塑料 管，塑料管末端接上小乳 胶管，在乳胶管上装上螺旋夹。 2. 关紧螺旋夹。柱内装入适量的 pH7.6 0.5M Tris-HCl 缓冲液，微开螺旋夹。让缓冲液缓 慢流出，赶走层析柱的流 出液引导塑料管内的气泡，柱中仍保留少量缓冲液，关紧螺旋夹。 3. 将减压除尽气泡的 DEAE-纤维素浆液沿层析柱管壁倒人柱中，使凝胶树脂在柱中保留 的缓冲液中自然沉降，待 凝胶树脂沉降至离层析柱柱床高约 1 cm 高度时，部分旋松螺旋夹，让柱 内溶液缓慢流出，注意此时的流速要极 其慢。再继续加入 DEAE-纤维素浆液，直至凝胶树脂自然 沉降后高达 10 cm 以上的柱床体积。缓冲液液面比凝胶 树脂层面高 1 cm 左右。 III. 平衡 当装柱完毕后，用 pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液上柱继续进行平衡，流速维持在 1 毫升/5 分钟（大约 4-5 滴/分）, 直至流出液的 pH 值与上柱缓冲液完全相同。 IV. 层析 1. 关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶树脂层面上的缓冲液至凝胶树脂层面与缓冲液液 面齐平。 2. 用吸管吸取实验一或实验二中提取的碱性磷酸单酯酶的粗酶溶液，小心沿柱壁缓缓加入 柱内。轻开螺旋夹，使 柱中缓冲液缓缓流出，让粗酶溶液进入纤维素凝胶树脂内，至与凝胶树脂层面齐平时。 3. 柱壁用少量 pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液小心洗涤 2-3 次，重复至使缓冲液液面与凝 胶树脂层面齐平。 4. 然后加入 pH7.6 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液，使缓冲液液面比凝胶树脂层面高 1-2 cm 左 右，保持流速 1 毫升/5 分钟 （大约 4-5 滴/分）。 V. 洗脱 1. 将梯度洗脱仪和层析柱连接好。 2. 在梯度洗脱仪中的 A（混合器）中加入 100 ml pH7.6 0.5M Tris-HCl 缓冲液，在梯度洗 脱仪中的 B（贮存器）内 加入 100 ml pH7.6 0.5M Tris-HCl（内含 0.3N NaCl）缓冲液。注意使 A（混合器）和 B（贮 存器）内的液面应处 于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡。 3. 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以 A 混合器内缓冲液旋转而无 明显旋涡为宜。 4. 打开梯度洗脱仪与层析柱的连接管道，依序打开 A（混合器）和 B（贮存器），开始对 层析柱进行梯度洗脱。保持流速 2 毫升/15 分钟（大约 3 滴/分），收集洗脱流出液，收集管速为：管 /15 分钟，收集各管依次测定 OD280 值并定性测酶活。 VI. 酶活的定性测定