第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫 载体( (Vector))。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体 质粒( Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制 和转录能力能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依 赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常 存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒 R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒 粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型( Stringent contro和松驰控制型( Relaxed contro)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制当染色体不复制时它也不能复制,通常每个细胞内 只含有1个或几个质粒分子如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制在每个细胞中 有许多拷贝,一般在20个以上如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时细胞内蛋白质合 成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷 贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在当两种质粒同时导入同一细胞 时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些 细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后占少数的质粒将会丢失因而在细胞后代中只有两 种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性( compat ibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳 定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性产生某些抗生素降解复杂有机物产 大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比质粒载 体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制 性内切酶识别位点的多克隆位点序列并去掉了大部分非必需序列使分子量尽可能减少以便于基因 工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组 克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因 的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型: 2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点:(3)能插入较大的外源DNA片段:(4)具有容易操 作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系 列和 pBluescript(简称pBS) 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增:收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 TritonⅩ-100可使 细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上, 同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性 片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性而共价闭合环状DNA( Covalently closed circular DNa,简称cDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体
1 第一章 质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫 载体(Vector)。细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从 1-200kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制 和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依 赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常 存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称 F 因子或性质粒)、 R 质粒(抗药性因子)和 Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内 只含有 1 个或几个质粒分子,如 F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中 有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合 成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷 贝数可由原来 20 多个扩增至 1000-3000 个,此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞 时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些 细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两 种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳 定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产 生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载 体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制 性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因 工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组 克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因 的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型； （2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源 DNA 片段；（4）具有容易操 作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在 1kb 至 10kb 之间，如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系 列和 pBluescript（简称 pBS）等。 从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 Triton X-100 可使 细胞膜裂解。经溶菌酶和 SDS 或 Triton X-100 处理后,细菌染色体 DNA 会缠绕附着在细胞碎片上, 同时由于细菌染色体 DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性 片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体 DNA 变性,而共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体
NA片段难以复性而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起而质粒DNA双链又恢复原状,重新 形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中 在细菌细胞内共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还 会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂分子就能旋转 而消除链的张力形成松驰型的环状分子称开环 DNA(Open circular DNA,简称 OCDNA):如果质粒 DNA的两条链在同一处断裂则形成线状DNA( Linear dna)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快 第二节材料、设备及试剂 材料 含pBS的 E coli h5a或JM系列菌株,1.5m塑料离心管(又称 eppendorf管),离心管架 设备 微量取液器(20μ山,20oμl0o0u),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅) 涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。 三、试剂 1、LB液体培养基( Luria- Bertani):称取蛋白胨( Tryptone)10g,酵母提取物( Yeast extract5g, NaCl10g,溶于800m去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升高压下蒸气 菌20分钟。 2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉高压灭菌 3、氨苄青霉素( Ampicillin,Amp)母液:配成50mgm水溶液,-20℃保存备用 4、溶菌酶溶液:用10mmol. Tris CI(pH8.0)溶液配制成l0mg/m,并分装成小份(如1ml)保 存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃 5、3 mol naAc(pH52):50ml水中溶解40.81 o naAc3H2O,用冰醋酸调pH至52,加水定容 至10om,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱 6、溶液Ⅰ:50mmoL葡萄糖,25 mmol/ Tris Cl(pH80),10 mmOLL EDTA(pH8.0)。溶液 Ⅰ可成批配制,每瓶100m高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱 7、溶液Ⅱ:0.2 molL NaoH(临用前用10 molL NaOH母液稀释),1%SDS 8、溶液Ⅲ:5 mol/L Kac60m,冰醋酸1!5ml,HO28.5ml,定容至10oml,并高压灭菌 溶液终浓度为K+3mol,Ac5mo/L 9RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10 mmol/ Tris CI(pH7.5,15 mmol/L NaCl中配成10 mg/ml 的溶液于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用15 ml eppendorf管分装成小份保存 于-20℃ 10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂并用等体积 的0.5 molL Tris Cl(pH80)和o.1 mol/L Tris CI(pH80)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到76 以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相 11、氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相 的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫 按体积体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿 即得酚氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。 12、TE缓冲液:10 mmo/ Tris Cl(pH8.0),1 mmoLL edta(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃
2 DNA 片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新 形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋 DNA 外，还 会产生其它形式的质粒 DNA。如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转 而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环 DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒 DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒 DNA 电泳时,同一质粒 DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 第二节 材料、设备及试剂 一、材料 含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株，1.5ml 塑料离心管(又称 eppendorf 管),离心管架。 二、设备 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。 三、试剂 1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g， NaCl 10 g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5, 加去离子水至总体积 1 升,高压下蒸气 灭菌 20 分钟。 2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成 10mg/ml,并分装成小份(如 1.5ml)保 存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解 40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调 pH 至 5.2, 加水定容 至 100ml, 分装后高压灭菌,储存于 4℃冰箱。 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液 Ⅰ可成批配制,每瓶 100ml,高压灭菌 15 分钟,储存于 4℃冰箱。 7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。 溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 9、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存 于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联,应在 160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1％的 8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积 的 0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和 0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上,因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相。 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相 的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿 即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、 TE 缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于 4℃
冰箱中 13. STET: 0.1 mol/L NaCl, 10mmol/L Tris CI(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5%Triton 14, STE: 0. Imol/L NaCl, 10mmol Tris- CI(pH8.0), Immol/L EDTA(pH8.0) 15、电泳所用试剂:(1)TBE缓冲液(5×):称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDT (pH80)20m,定溶至100mnl。(2)上样缓冲液(6×):0.25%溴酚蓝,40%(w)蔗糖水溶液 第三节操作步骤 、细菌的培养和收集 将含有质粒pBS的DHsa菌种接种在LB固体培养基(含5opg/ ml Amp)中,37℃培养12-24小时 用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μ g/ml Amp中,37℃振荡培养约12小时至对 生长后期 二、质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法 共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样所得DNA有一定纯度可满足限制酶切割、电泳分析 的需要。 (一)、煮沸法 1、将15ml培养液倒入 eppendorf管中4℃下12000g离心30秒 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽 3、将菌体沉淀悬浮于120 mI STEt溶液中,涡旋混匀。 4、加λ1om新配制的溶菌酶溶液( 10mg/m),涡旋振荡3秒钟 5、将 eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟 7、用无菌牙签从 eppendorf管中去除细菌碎片 8、取20m进行电泳检查 注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA 2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶 3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验如限制性内切酶消化亚克隆 及连接反应等 (二)、碱法 1、取1.5m培养液倒入1 5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒 2、弃上清将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽 3、菌体沉淀重悬浮于100μ溶液I中(需剧烈振荡,室温下放置5-10分钟 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μ,盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf管数次以混匀内容物(千万 不要振荡)冰浴5分钟。 5加入150预冷的溶液盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒使沉淀混匀冰浴中510 ,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净 eppendorf管中,加入等体积的酚氯仿(1:1),振荡混匀4℃下12000离心5分
3 冰箱中。 13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。 14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15、 电泳所用试剂：（1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。 第三节 操作步骤 一、 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在 LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。 用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基(含 50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约 12 小时至对 数生长后期。 二、 质粒 DNA 少量快速提取 质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用。这些方法 共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得 DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析 的需要。 （一）、煮沸法 1、将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中,4℃下 12000ｇ离心 30 秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中, 涡旋混匀。 4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡 3 秒钟。 5、将 eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。 6、用微量离心机 4℃下 12000g 离心 10 分钟。 7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。 8、取 20ml 进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶 菌。 3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA,但 RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆 及连接反应等。 （二）、 碱法 1、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,4℃下 12000g 离心 30 秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置 5-10 分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万 不要振荡),冰浴 5 分钟。 5、加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10 秒,使沉淀混匀,冰浴中 5-10 分钟,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。 6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下 12000g 离心 5 分 钟
7、将水相移入干净 eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇振荡混匀后置于-20℃冰箱中20 分钟,然后4℃下12000g离心10分钟 8、弃上清将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70%乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥 10、将沉淀溶于20μTE缓冲液(pH8.0,含20 g/ml rnaseA)中,储于-20℃冰箱中 注意]1.提取过程应尽量保持低温 2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要采用酚氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好要将 蛋白尽量除干净需多次抽提 3.沉淀DNA通常使用冰乙醇在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也 可用异丙醉(一般使用等体积且沉淀完全,速度快但常把盐沉淀下来所以多数还是用乙醇 三)、 Wizard少量DNA纯化系统 Promega公司的Ward少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟 提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括10m细胞 悬浮液,10ml细胞裂解液:10ml中和液,50 ml wizard少量DNA纯化树脂,5oml柱洗液(使用前 加95%乙醇至120ml)和50支 Wizard微型柱 1-3ml过夜培养细胞液4℃下12000离心1-2分钟。 2、去除上清液,菌体细胞悬浮于200μ细胞悬浮液中充分混合并移入 eppendorf管中 3、加200μd细胞裂解液,颠倒离心管数次,直到溶液变清亮 4、加200u中和液颠倒离心管数次。 5、4℃下12000g离心5分钟,取上清液于新的 eppendorf管中 6、加1 mI wizard少量DNA纯化树脂颠倒离心管数次以充分混匀 7、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒与 Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注 射筒中,并用注塞轻推使混合物进入微型柱 8、将注射器与微型柱分开取出注塞,再将注射筒与微型柱相连加入2m柱洗液并用注塞轻推 使柱洗液进入微型柱 9、取出微型柱置于 eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10、将微型柱放在一个新 eppendorf管中,加50udTF(或水)于微型柱中,静止1分钟后,4℃下 1l、丢弃微型柱,将 eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。 注意]树脂使用前应充分混匀如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提 取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化常用柱层析法和氯化绝梯度离心法 (一)、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250m,4℃下5000g离心15分钟,弃上 清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50m用冰预冷的STE中(此步可省略)
4 7、将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中 20 分钟，然后 4℃下 12000g 离心 10 分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g 离心 5-10 分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于 20μl TE 缓冲液(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。 [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将 蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。沉淀 DNA 也 可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 （三）、Wizard 少量 DNA 纯化系统 Promega公司的Wizard 少量 DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15 分钟。 提取的质粒可直接用于 DNA 测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于 50 次 1-3ml 质粒培养液的分离和纯化，试剂包括 10ml 细胞 悬浮液，10ml 细胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂，50ml 柱洗液（使用前 加 95%乙醇至 120ml )和 50 支 Wizard 微型柱。 1、 1-3ml 过夜培养细胞液 4℃下 12000g 离心 1-2 分钟。 2、去除上清液，菌体细胞悬浮于 200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入 eppendorf 管中。 3、 加 200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。 4、加 200μl 中和液,颠倒离心管数次。 5、4℃下 12000g 离心 5 分钟，取上清液于新的 eppendorf 管中。 6、加 1ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与 Wizard 微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注 射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。 8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推， 使柱洗液进入微型柱。 9、取出微型柱置于 eppendorf 管中,离心 2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10、将微型柱放在一个新 eppendorf 管中，加 50μl TE(或水)于微型柱中，静止 1 分钟后，4℃下 12000g 离心 20 秒。 11、丢弃微型柱，将 eppendorf 管中的质粒 DNA 贮于 4℃或-20℃冰箱。 [注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用 25-37℃水浴处理 10 分钟。 三、质粒 DNA 的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒 DNA,为此需要大量提 取质粒 DNA。大量提取的质粒 DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含 pBS 质粒的细菌培养液 250ml，4℃下 5000g 离心 15 分钟,弃上 清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于 50ml 用冰预冷的 STE 中（此步可省略）
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于5m溶液I中充分悬浮菌体细胞。 5、加入12m新配制的溶液Ⅱ,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物冰浴10分 6、加9ml用冰预冷的溶液Ⅲ,摇动离心管数次以混匀内容物冰上放置15分钟,此时 色絮状沉淀。 7、4℃下5000g离心15分钟。 8、取上清液加入50 mI RNA酶A(l0mgm),37℃水浴20分钟。 9、加入等体积的饱和酚氯仿振荡混匀4℃下1200g离心10分钟 10、取上层水相,加入等体积氯仿振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。 1l、取上层水相,加入1/5体积的4 molL Nac和10%PEG(分子量6000,冰上放置60分钟。 12、4℃下1200g离心15分钟,沉淀用数m70%冰冷乙醇洗涤,4℃下12000g离心5分钟。 13、真空抽干沉淀,溶于500mlTE或水中 注意].提取过程中应尽量保持低温。 2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后操作应混和,切忌剧烈振荡 3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶利用RNA酶耐热的特性使用时应先对该酶液进行热处 理(80℃1小时)使DNA酶失活 (二)、 Hazard大量DNA纯化系统 碱法大量提取DNA往往需要很长的时间 Promega公司的 Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又 快速,只需要离心和真空抽干这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得lmg以上的高质量 的质粒DNA(200-2000p)。该系统不需要酚和氯仿抽提纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中,不 含任何盐份,可以直接用于DNA序列分析和酶切反应,也可以用于在核酸酶抑制剂(如 RNasin) 存在的条件下进行体外转录反应等 系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500m质粒培养液的分离和纯化试剂包括:150m细 胞悬浮液,150ml细胞裂解液,150m中和液,100 ml wizard大量DNA纯化树脂,125 ml wizard 柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。 1、100-500ml细胞培养液置离心管中,22-25℃下5000离心10分钟,所得细胞沉淀充分悬浮于 细胞悬浮液中。 2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡细胞裂解完全时, 溶液会变清,这一步需要20分钟 3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次,并使之混匀。 4、14000g,2225℃离心15分钟。 5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中 0.5倍体积的异丙醇混合均匀,14001922-25℃下离心15分钟。 7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2mT缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解 8、加10 ml wizard大量DNA纯化树脂溶液,并涡旋混合。 9、每一个样品,使用一支 Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上( Promega产品,与此配套) 将树脂DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂DNA混合液 11、将树脂灬NA混合液抽干后加13m柱子洗脱溶液至离心管中,对管底部的树脂/NA进行
5 3、同步骤 1 方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中,充分悬浮菌体细胞。 5、加入 12ml 新配制的溶液 II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴 10 分 钟。 6、加 9ml 用冰预冷的溶液 III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置 15 分钟,此时应形成白 色絮状沉淀。 7、4℃下 5000g 离心 15 分钟。 8、取上清液,加入 50ml RNA 酶 A(10mg/ml), 37℃水浴 20 分钟。 9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下 12000g 离心 10 分钟。 10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下 12000g 离心 10 分钟。 11、取上层水相,加入 1/5 体积的 4mol/L NaCl 和 10% PEG(分子量 6000), 冰上放置 60 分钟。 12、4℃下 12000g 离心 15 分钟, 沉淀用数 ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下 12000g 离心 5 分钟。 13、真空抽干沉淀，溶于 500ml TE 或水中。 [注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。 2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。 3. 由于 RNA 酶 A 中常存在有 DNA 酶,利用 RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处 理(80℃ 1小时),使 DNA 酶失活。 （二）、Wazard 大量 DNA 纯化系统 碱法大量提取 DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的 Wiazrd 大量 DNA 纯化系统既简单又 快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从 500ml 培养液中在 3 小时以内获得 1mg 以上的高质量 的质粒 DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的 DNA 溶于水或 TE 缓冲液中，不 含任何盐份，可以直接用于 DNA 序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如 RNasin） 存在的条件下进行体外转录反应等。 该系统中含有的试剂和柱子可以用于10 次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细 胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂，125ml Wizard 柱子洗脱溶液和 10 支 Wizard 带有存储离心管的柱子。 1、100-500ml 细胞培养液置离心管中, 22-25℃下 5000g 离心 10 分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于 细胞悬浮液中。 2、 加 15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时, 溶液会变清,这一步需要 20 分钟。 3、 加 15ml 中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。 4、 14000g,22-25℃离心 15 分钟。 5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。 6、 加 0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心 15 分钟。 7、 弃上清,悬浮 DNA 沉淀于 2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。 8、 加 10ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂溶液, 并涡旋混合。 9、每一个样品,使用一支 Wizard 大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套)。 10、将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。 11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加 13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行
洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液),并加入柱子中。 12、真空抽干所加入的洗脱 13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干 14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的树脂,柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管 中2500pm(1300g)离心5分钟。 15、取出柱子,真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中,2500pm(1300g)离 5分钟 16、在柱子中加入1.5m65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子 离心管5分钟。 17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中盖上盖子,储存在 4℃或-20℃备用 注意]1.在使用之前系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125m95%乙醇。 2.纯化树脂必须混匀后再用 (三)、 Sephrose2B柱纯化质粒DN 碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的 DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用 Sepharose2B或 Sepharose4B进行纯化该方法具有快 速条件温和,重复性好载体物质可以再利用等优点因而已广泛用于质粒DNA纯化。 1、将 Sepharose2B经含0.1%SDS的TE(pH80)平衡后上柱。 2、将至多1m的DNA溶液铺在 Separase2B柱上。 3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1%SDS的TE(pH8.0)贮液瓶 4、以lml流出液为1份进行收集 5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第 一个峰中 6、合并所有含质粒的洗脱液用等体积的酚氯仿(1)抽提,4℃下12000g离心2分钟将上层水 相转入新管。 7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇,20℃下沉淀10分钟然后4℃下12000g离心10分钟弃去 上清液 8、沉淀加70%乙醇洗涤4℃下12000g离心10分钟弃去上清液 9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。 注意]在装柱过程中要防止柱床中出现断裂或气泡现象要使界面保持平整。对新装成的柱,应 用含0.1%SDS的TE平衡,以使柱内的凝胶均匀 思考题 1.质粒的基本性质有哪些? 2.质粒载体与天然质粒相比有哪些改进? 3.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题? 第二章DNA酶切及凝胶电泳 第一节概述
6 洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。 12、真空抽干所加入的洗脱。 13、 再加 12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。 14、 加入 5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管 中,2500rpm(1300g)离心 5 分钟。 15、 取出柱子，真空抽干 5 分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离 心 5 分钟。 16、在柱子中加入 1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或 TE,1 分钟后 2500rpm(1300g)离心柱子/ 离心管 5 分钟。 17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒 DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在 4℃或-20℃备用。 [注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按 1:1 加入 125ml 95％乙醇。 2. 纯化树脂必须混匀后再用. （三）、Sephrose 2B 柱纯化质粒 DNA 碱法提取的质粒 DNA 即使用 RNA 酶处理,仍会含有少量 RNA。当有些试验需无 RNA 污染的 DNA 制品时,则需进行进一步纯化。一般常用 Sepharose 2B 或 Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快 速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒 DNA 纯化。 1、将 Sepharose 2B 经含 0.1% SDS 的 TE（pH8.0）平衡后上柱。 2、将至多 1ml 的 DNA 溶液铺在 Sepharase 2B 柱上。 3、待 DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有 0.1% SDS 的 TE(pH8.0)贮液瓶。 4、以 1ml 流出液为 1 份进行收集。 5、对每一管测定其 OD260 值,以确定哪些管中含有质粒 DNA。通常质粒 DNA 在柱上流出的第 一个峰中。 6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下 12000g 离心 2 分钟,将上层水 相转入新管。 7、加入 2 倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀 10 分钟,然后 4℃下 12000g 离心 10 分钟,弃去 上清液。 8、沉淀加 70%乙醇洗涤,4℃下 12000g 离心 10 分钟,弃去上清液。 9、 沉淀真空抽干,重新溶于 TE 或无菌水中。 [注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应 用含 0.1% SDS 的 TE 平衡, 以使柱内的凝胶均匀。 思考题 1. 质粒的基本性质有哪些？ 2. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？ 3. 在碱法提取质粒 DNA 操作过程中应注意哪些问题？ 第二章 DNA 酶切及凝胶电泳 第一节 概 述
DNA的限制性内切切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异 位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于ATP的存在。I类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类 酶在识别位点上切割DNA分子然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶 (限制酶)它切割某一特异的核苷酸序列,另一种为独立的甲基化酶它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的 限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别 长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列如EoRI识别六个核苷酸序列5-G」ATTC-3) 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中有的在对称轴处切割产生平 末端的DNA片段(如SmaI:5- CCCIGGO-3),有的切割位点在对称轴一侧产生带有单链突出末端的 DNA片段称粘性未端,如 EcoR I切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5.G」 AATTC..3→5.. GAATTC..3 3. CTTAATG…5→3.. CTTAA G.5 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限 制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时会影响 其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必 须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液则可同时水解。若需要不同的盐浓度 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也 可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚氯仿抽提,加0.1倍体积3 molL naAc和2倍体积无水乙 醇,混匀后置-π0℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶 酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的 RFLP限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多 种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对 位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为05-1吗。限制性 内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37℃)。对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1吗gDNA加1单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速 可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料 溴化乙啶( Ethidium bromide,EB)染色在紫外光下至少可以检出1-lng的DNA条带,从而可以确定 DNA片段在凝胶中的位置。此外还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带用于以后的克隆 操作
7 一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异 位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类 酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶 (限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的 限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别 长度为4至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平 末端的 DNA 片段(如 SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限 制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响 其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必 须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度, 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也 可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶 酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多 种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对 位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为 0.5-1μg。限制性 内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶,消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加 2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二. 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速， 可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出 1-10ng 的 DNA 条带,从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带,用于以后的克隆 操作
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围 较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在 和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高甚至 相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作 比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板 凝胶电泳装置进行DNA电泳 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定 1、DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大 则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁 移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于05kb的 DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为03-07%,DNA片段大 小间于两者之间则所需胶浓度为08-1.0%。 3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关还和它本身构象有关。相 同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快, 而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒 DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种 限制性内切酶分别水解,然后电泳如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA 4、电源电压 在低电压时线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分 子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长片段越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2Kb的DNA片段的分辨率达到最 大所加电压不得超过5vm 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状 和带缺口的环状DNA,使其刚性更强还会使线状DNA迁移率降低15%。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配 制凝胶),电导率最小DNA几乎不移动在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很 高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性 对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE含EDTA(pH!.0)和Tris-乙酸]TBE(Tri 硼酸和EDIA,TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温 第二节材料、设备及试剂 材料 λDNA:购买或自行提取纯化;重组pBS质料或pC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液:购买成
8 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围 较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在 强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至 相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作 比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板 凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。 琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反比，分子越大 则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁 移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 DNA 分子的大小。分离小于 0.5kb 的 DNA 片段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于 10kb 的 DNA 分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA 片段大 小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1.0%。 3、 DNA 分子的构象 当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相 同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋 DNA 移动最快, 而线状双链 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种 限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。 4、 电源电压 在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分 子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最 大,所加电压不得超过 5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状 和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强,还会使线状 DNA 迁移率降低 15％。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配 制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加 10×电泳缓冲液),则电导很 高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE[含 EDTA (pH8.0)和 Tris-乙酸],TBE(Tris- 硼酸和 EDTA),TPE(Tris-磷酸和 EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。 第二节 材料、设备及试剂 一、 材料 λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组 pBS 质料或 pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成
品;Hind酶及其酶切缓冲液:购买成品;琼脂糖( Agarose)进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、设备 水平式电泳装置,电泳仪台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射 仪,照相支架,照相机及其附件 三、试剂 1、5×TBE电泳缓冲液:配方见第一章。 2、6×电泳载样缓冲液:0.25%溴粉蓝,40%(w)蔗糖水溶液,贮存于4℃。 3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将BB配制成10mgm用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 第三节操作步骤 DNA切反应 1、将清洁干燥并经灭菌的ε bendorf管(最好θ.5m)编号,用微量移液枪分别加入 DNA lug和 相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2山再加入重蒸水使总体积为19山将管内溶液混匀后加入1u 酶液用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实 验成败的关键要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降 2、混匀反应体系后将 eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保 温2-3小时,使酶切反应完全。 3、每管加入2山l0. I moVL EDTA(pH!.0,混匀,以停止反应置于冰箱中保存备用。 二、DNA分子量标准的制备 采用 EcoR I或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准DNA为长度约50kb 的双链DNA分子,其商品溶液浓度为05mgm,酶解反应操作如上述。Hind切割DNA后得到8 个片段长度分别为231,9.4,66,44,23,20,0.56和0.12kb。 EcoRI切割DNA后得到6个片段,长 度分别为21.2,74,58,56,49和2kb。 三、琼脂糖凝胶的制备 1、取5×TBE缓冲液20m加水至20om配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用 2、胶液的制备:称取04g琼脂糖,置于200m锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入 微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时 摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜以减少水份蒸发 3、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约lcm)紧密封住。将封好的胶槽置于 水平支持物上插上样品梳子注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5ghm《也可不把EB 加入凝胶中而是电泳后再用0.sψgml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶 封橡皮膏内侧待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒 胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀速度也不可太快否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳 子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 因边缘效应样品槽附近会有一些隆起阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓 冲液 4、加样:取loμ酶解液与2μ6×载样液混匀用微量移液枪小心加λ样品槽中。若DNA含量 偏低则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换ip头,以防
9 品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、 设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射 仪, 照相支架, 照相机及其附件。 三、 试剂 1、 5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将 EB 配制成 10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。 第三节 操作步骤 一、 DNA 酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管(最好 0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入 DNA 1μg 和 相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl,再加入重蒸水使总体积为 19μl,将管内溶液混匀后加入 1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实 验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降 低。 2、 混匀反应体系后,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保 温 2-3 小时,使酶切反应完全。 3、 每管加入 2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 二、DNA 分子量标准的制备 采用 EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA 为长度约 50kb 的双链 DNA 分子,其商品溶液浓度为 0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII 切割 DNA 后得到 8 个片段,长度分别为 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和 0.12kb。EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 个片段,长 度 分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb。 三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取 5×TBE 缓冲液 20ml 加水至 200ml,配制成 0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖,置于 200ml 锥形瓶中,加入 50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入 微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时 摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于 水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙。 向冷却至 50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为 0.5μg /ml(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶 封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒 胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳 子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入 0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓 冲液。 4、 加样：取 10μl 酶解液与 2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若 DNA 含量 偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换 tip 头,以防
止互相污染注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿 5、电泳:加完样后合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5ggml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或己加有EB的电泳胶板。 DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩, 以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶 片,光圈56曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择) 8、DNA分子量标准曲线的制作:在放大的电泳照片上以样品槽为起点用卡尺测量DNA的 EcoR I和Hind酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标以迁移距离 为横坐标在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线 9、DNA酶切片段大小的测定:在放大的电泳照片上用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离 根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值进一步计算出各片段的分子量大小(若用 单对数坐标纸来绘制标准曲线则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片 段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离 10、DNA酶切片段排列顺序的确定:根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环 状图或直线图表示即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 注意]酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应 2、酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:在最适反应条件下,1小时完全降解1mg IDNA的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA不象DNA那样易于降解,需适当增加酶的使 用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应 3、市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释 另外,酶通常保存在50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在Ⅵ10之下,否则,酶 活性将受影响。 4、观察DNA离不开紫外透射仪可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA 5、EB是强诱变剂并有中等毒性配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃 6、当EB太多胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡30分钟后再观察。 思考题 1.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因? 2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响? 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中 般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如
10 止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在 60-80V,电流在 40mA 以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时,停止电泳。 6、 染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中,室温下染色 20-25 分钟。 7、 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 EB 的电泳胶板。 DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩, 以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶 片，光圈 5.6,曝光时间 10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择)。 8、 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量 λDNA 的 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离 为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下 DNA 分子量的标准曲线。 9、 DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出 DNA 样品各片段的迁移距离, 根据此数值,在 DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用 单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出 DNA 片段的大小)。反之,若已知 DNA 片 段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 10、 DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照 DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环 状图或直线图表示,即成该 DNA 分子的限制性内切酶图谱。 [注意] 1.酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解 1mg lDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的 DNA 不象 lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使 用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。 另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下，否则，酶 活性将受影响。 4、 观察 DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA 分子有切割作用。从胶上回收 DNA 时, 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割 DNA。 5、EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。 凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、 当 EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后再观察。 思考题 1. 如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被切动, 你认为可能是什么原因？ 2. 琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？ 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节 概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中, 一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如