第三章基因工程制药工艺 1.基因工程制药微生物表达系统 2. 基因工程大肠杆菌的构建技术 3. 基因工程菌的发酵培养与控制 4. 重组人干扰素生产工艺
1. 基因工程制药微生物表达系统 2. 基因工程大肠杆菌的构建技术 3. 基因工程菌的发酵培养与控制 4. 重组人干扰素生产工艺 第三章 基因工程制药工艺
基因工程制药 工程菌种类 基因工程菌： 微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表 达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生 物体。 种类： 细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物
基因工程菌： 微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表 达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生 物体。 种类： 细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 3.1基因工程制药微生物表达系统 3.1.1大肠杆菌表达系统 3.1.1酵母表达系统
3.1 基因工程制药微生物表达系统 3.1.1 大肠杆菌表达系统 3.1.1 酵母表达系统 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 3.1.1 大肠杆菌表达系统 1、大肠杆菌(Eschericlia coli)形态特征 细胞：G一，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般 无荚膜。裂殖。 菌落：白色至黄白色，光滑，直径2-3mm。 周质 细胞壁 外腹 细胞 纤毛 核糖体 间体 细胞质 鞭毛 拟核 DNA
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般 无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。 3.1.1 大肠杆菌表达系统 1、大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 2、生化与遗传特性 能在仅有碳水化合物和氨、磷及微量元素的无 机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。 基因工程中使用菌株：K一12株的衍生菌株。 基因组：4.6Mb,3000多种蛋白质。 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒
2、生化与遗传特性 能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无 机 盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。 基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 3、质粒载体 Ec001092674 BstAPI 179 4atl2617 Ndel 183 Sspl 2501 Ehel 235 Pdml 2294 Bcgl 2215 2486 146/ 236 lacz MCS Scal 2177 复制起始点 469 选择标记 pUC18/19 Sapl 683 2686bp 多克隆位点 852. Aflll,BspLU111 806 GS1784, 1626 G10l1779 1466 Ec031l1766 Eam105l1694 p(pMB1) Ga1l1217
复制起始点 选择标记 多克隆位点 3、质粒载体 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 质粒类型 严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101; 。松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和coIE1。 。克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 测序质粒：用于基因测序。 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。 ~穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 。表达质粒：能表达基因产物
质粒类型 ❖ 严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101； ❖ 松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。 ❖ 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 ❖ 测序质粒：用于基因测序。 ❖ 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。 ❖ 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 ❖ 表达质粒：能表达基因产物 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 4、产物表达形式 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 可溶性蛋白质：存在于细胞质 周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有 利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。 胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培 养液中
4、产物表达形式 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 可溶性蛋白质：存在于细胞质 周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有 利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。 胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培 养 液中。 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 5、优点和不足 发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。 具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70 %)，培养周期短，抗污染能力强。 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。 细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素， 具有抗原性，产生热源。 N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应
5、优点和不足 发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。 具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70 ％），培养周期短，抗污染能力强。 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。 细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素， 具有抗原性，产生热源。 N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。 基因工程制药 工程菌种类
基因工程制药 工程菌种类 6、应用 大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。 ÷多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34）、利尿钠肽) 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化) 8 细胞因子类：5种干扰素α(1种PEG化)、干扰素β和 Y,2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、 白介素-1拮抗剂 溶栓酶类：rPA 白喉毒素-IL2融合蛋白、0sA脂蛋白（疫苗）等
6、应用 ❖ 大量外源基因能超量的表达， 18种药物上市。 ❖ 多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽） ❖ 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化) ❖ 细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和 ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、 白介素-1拮抗剂 ❖ 溶栓酶类：rPA ❖ 白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。 基因工程制药 工程菌种类