《生化大实验》
《生化大实验》
实验课程简介 生化大实验是一门综合性的实验课程, 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备,纯化,分析等综合性实验,在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术(如滴定 比色、层析、电泳等)的基础上,训练学 生的综合实践动手能力,掌握蛋白质、酶 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术
实验课程简介 生化大实验是一门综合性的实验课程， 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、 比色、层析、电泳等）的基础上，训练学 生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术
目录 实验一蛋白质含量的测定 实验二离子交换法血清纯化IgG 实验三离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五等电聚焦法测定样品的等电点 实验六质粒的分离与纯化 实验七PCR扩增目的基因片段 实验八酶联免疫吸附实验
目 录 实验一 蛋白质含量的测定 实验二 离子交换法血清纯化IgG 实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五 等电聚焦法测定样品的等电点 实验六 质粒的分离与纯化 实验七 PCR扩增目的基因片段 实验八 酶联免疫吸附实验
实验一蛋白质含量的测定 (一)考马斯亮蓝法 【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方 法。 【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质一染 料结合法的原理,定量测定微量蛋白质浓度快速、 灵敏的方法
实验一 蛋白质含量的测定 （一）考马斯亮蓝法 【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方 法。 【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染 料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、 灵敏的方法
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色 形式,红色棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结 合后有红色-棕黑色和蓝色形式,最大光吸收 由465m变成595mm,测定595mm吸光的 增加量,可以测定与其结合的蛋白质的量 蛋白质与染料结合速度很快,2min就可 以反应完全,并可以稳定仙h,蛋白质染料复 合物有很大的消光系数,使得测定蛋白质浓 度是灵敏度很高。测定范围为10-100yg蛋白 质,微量测定时达到110μg蛋白质。此反应 反复性好精度高,线性关系好
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色 形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结 合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收 由465nm变成595nm，测定595 nm吸光的 增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快，2min就可 以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复 合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓 度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白 质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应 反复性好精度高，线性关系好
【实验仪器及用品】 1.标准蛋白液(01mgm)029结晶牛 血清白蛋白用09%NaC|稀释到2000ml 2.09%Nac 3.考马斯亮蓝试剂:100mg考马斯亮蓝 G250溶于50m5%乙醇中,加100m85%磷 酸,蒸馏水稀释1000m,滤纸过滤。 4.待测蛋白:人血清,用前用0.9%NaC 稀释200倍 5.漩涡混合器
【实验仪器及用品】 1. 标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛 血清白蛋白用0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2. 0.9%NaCl 3. 考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝 G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷 酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。 4. 待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl 稀释200倍。 5. 漩涡混合器
6.移液管0.5m(Ⅹ2),10m(×2), 5m(×1) 7.分光光度计 8.试管15cm×15cm(×8 9.量筒100m(×1 10.电子分析天平 11.试管架(×1)
6. 移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2）， 5ml（×1） 7. 分光光度计 8. 试管1.5cm×15cm (×8) 9. 量筒100ml(×1) 10. 电子分析天平 11. 试管架(×1)
实验内容及步骤】 标准曲线线的绘制 取7支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。 以A595为纵坐标,标准蛋白质年浓度为横坐标,绘制 标准曲线。 试剂号1 3 5 6 试剂 1mgm标准蛋白液m001020.30406 0.15mol/l Nacl/ml 10.90.8070.604 考马斯亮蓝染液ml 4.04.04.04.04040 摇匀,1小时内以1号管为空白对照,在595m处比色 A595
【实验内容及步骤】 一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。 以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制 标准曲线。 试剂号 试剂 1 2 3 4 5 6 1mg/ml标准蛋白液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.15mol/L NaCl/ml 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 考马斯亮蓝染液/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 摇匀，1小时内以1号管为空白对照，在595nm处比色 A595
2.未知样液的测定 另取一干净试管,加入样品10m及考马斯亮蓝 染液40m,混匀,室温静置3min,于波长595nm处 比色,读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。 【注意事项】 1、如果测定的要求很严格,可以在试剂加入5 20min内测定吸光度,在这段时间内样色很稳定。 2、测定中,蛋白质染料复合物会吸附在比色皿 上,实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净
2. 未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝 染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处 比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。 【注意事项】 1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5- 20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿 上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净
【思考题】 1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测 定蛋白质浓度。 (1)样品不容易溶解,但要求结果很准确 (2)要求在半天内测定60个样品。 (3)要求很迅速的测定一系列试管(30只)中溶液 的蛋白质浓度。 2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点
【思考题】 1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测 定蛋白质浓度。 （1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。 （2）要求在半天内测定60个样品。 （3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液 的蛋白质浓度。 2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点