第6章吸光光度法 教学目的:掌握光度法的基本原理.了解光度分析条件的控制,分光光度 法的应用范围。 教学重点:Beer定律:光度分析的应用 教学难点:光吸收原理;光度分析的准确度。 吸光光度法∶基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点:灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1概述 6.1.1吸光光度法的特点 1.光的基本性质 紫外光:200-400nm可见光:400-750nm红外:0.75-50μm 单色光:单一波长的光。复合光:由不同波长的光组成的光 互补色光:按一定比例混合,能够组成白光的两种光互称为互补色光。见p216 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色 两互补色按一定比例混合后,可得到白色。 2.吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级,其能量差也不同,因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图,p215,图6-1 吸收光谱曲线:A~C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度,在最大吸收波长处 测定吸光度,则灵敏度最高 a.max与c无关b.Axc 6.1.2光吸收的基本定律 1.朗伯一比尔定律 1760年, Lambert用实验指出,当光通过透明介质时,光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852年,Beer研究证明了,光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比,在溶液中即与吸光质点的浓度成正比 吸光度:A=12=Kbc透光率:T=1 A=lg-=lg 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收(光)系数E cm A=cbcE:摩尔吸收系数,只与波长有关。单位:L.cm.mol 物理意义:一定λ下,b=1cm,c=1mol/L时的吸光度。 实际工作中不能用c=1mol/L的溶液测吸光度(A=0.2-0.7)。c能反映方法的灵敏 度,光度法测定E:10,一般E:10°已很灵敏 (2)桑德尔灵敏度指数:S(μg/cm2) 在λmax时,A=0.01下,单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量
6－1 第6章 吸光光度法 教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度 法的应用范围。 教学重点：Beer 定律；光度分析的应用。 教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。 吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 6.1 概述 6.1.1 吸光光度法的特点 1．光的基本性质 紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50m 单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。 互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见 p216。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。 两互补色按一定比例混合后，可得到白色。 2．吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图，p215，图 6－1。 吸收光谱曲线：AC 曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处 测定吸光度，则灵敏度最高。 a.max 与 c 无关 b. Ac 6.1.2 光吸收的基本定律 1． 朗伯－比尔定律 1760 年，Lambert 用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比。1852 年，Beer 研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的 数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度： 0 lg I A Kbc I = = 透光率： 0 I T I = 0 1 lg lg I A I T = = 2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 （1）摩尔吸收（光）系数 A＝Kbc b：cm c：mol/L A=bc :摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1 .mol-1 物理意义：一定下，b＝1cm，c＝1 mol/L 时的吸光度。 实际工作中不能用 c＝1 mol/L 的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。能反映方法的灵敏 度，光度法测定：104，一般:105 已很灵敏。 （2）桑德尔灵敏度指数：S （g/cm2） 在max 时，A=0.001 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量
S与E的关系:A=0.001=cbc,bc=0.001/ s=b(cm)×c(m0l/dm)×M(g/1mo)×10g/g=001×M×10=2M(g/cm) 例>Fe2与邻二氮菲生成红色络合物,=1.1×10 灵敏度高 Fe2与磺基水杨酸络合物,g=5.8×103, 双硫腙与Pb的ε=6.8×10°,S=Mε=207/6.8×10′=0.0030(ug/cm2) 双硫腙与Cu的ε=4.52×10,S=M=63.5/4.52×10=0.0014(ug/cm)灵敏度高 3.吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1,A2,Aa,则总吸光度为 A=A+A2+.+A。(据此可进行多组分的测定) 6.1.3比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法:比较透过光的强度 标准色阶:在相同条件下显色,目视比较。 特点:灵敏度高,准确度低,不同人看,结果不同,不符合朗伯一比尔定律也可用目视 比色法,因为比较的是透过光。 2.光电比色法:比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好 3.吸光光度法:与光电比色法的原理相同,只是二者获得单色光的方法不同,前者使用滤光 片,后者使用光栅、棱镜,因而比光电比色法的准确度和选择性好 4.分光光度计及其基本部件:光源一单色器一比色皿(吸收池)一检测器一显示器 (1)光源钨丝灯:可见、红外400-1000m氢灯或氘灯:紫外160-350nm (2)单色器 a.滤光片:有机玻璃片或薄膜,利用颜色互补原理。 b.棱镜:根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 C.光栅:在玻璃片或金属片上刻划均匀的线,1200条/m,衍射、干涉原理 (3)吸收池:玻璃:可见,石英:紫外、可见 (4)检测器:光电转换器件(光电管、光电倍增光,光电二极管阵列)。利用光电效应,光 照产生光电流,测定光电流的大小 (5)显示器:检流计:72型。数字显示:722型。数字打印:U-240 6.2光度分析法的设计 6.2.1显色反应:将待测组分转化成有色化合物的的反应。M+L=ML 1.要求:(1)选择性好;(2)灵敏度高,ε>10’:(3)有色化合物M要稳定,不分解 (4ML的组成要一定(只M无MLn):(5Ⅻ与L颜色差别大,吸收峰波长差:Δλ>6On 2.显色剂:满足以上要求。有机显色剂 6.2.2显色条件的选择 1.溶液的酸度:M+L=M(显色剂L存在酸效应αL() a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 C.影响M的组成和稳定性,如Fe+-磺基水杨酸pH组成颜色 紫红 棕褐 8-101:3 黄色 2.显色剂用量:显色剂过多有时会引起副反应,加入量要严格控制,可通过实验确定。 3.温度:通过实验确定温度范围,通常在室温下进行
6－2 S 与的关系：A＝0.001＝bc，bc＝0.001/ S=b(cm)c(mol/dm3 )M(g/mol)106 g/g＝ 3 0.001 10 M M = (g/cm2 ) Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，＝1.1104 ， 灵敏度高 Fe2+与磺基水杨酸络合物，＝5.8103， 双硫腙与 Pb 的＝6.8104，S＝M/＝207/6.8104 =0.0030(g/cm2 ) 双硫腙与 Cu 的＝4.52104，S＝M/＝63.5/4.52104 =0.0014(g/cm2 ) 灵敏度高 3．吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为 A1，A2，…An，则总吸光度为： A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定） 6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。 特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律也可用目视 比色法，因为比较的是透过光。 2.光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光 片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4.分光光度计及其基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器 （1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm 氢灯或氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器 a． 滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b． 棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 c． 光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理 （3）吸收池：玻璃:可见, 石英:紫外、可见 （4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光 照产生光电流，测定光电流的大小。 （5）显示器：检流计：72 型。数字显示：722 型。数字打印：UV－240。 6.2 光度分析法的设计 6.2.1 显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML 1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，>104；（3）有色化合物 ML 要稳定，不分解； （4）ML 的组成要一定（只 ML 无 MLn）；（5）ML 与 L 颜色差别大,吸收峰波长差：>60nm. 2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂 6.2.2 显色条件的选择 1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂 L 存在酸效应L（H）） a． 影响显色剂的溶度 b． 影响 M 的存在状态 c． 影响 ML 的组成和稳定性，如 Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色 2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。 3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行
4.溶剂:一般螯合物在有机溶剂中溶解度大,提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCNˉ在水 中大部分离解,几乎无色:在丙酮中呈蓝色 显色时间:通过实验找出适宜的显色时间。 6.干扰组分:共存组分与显色剂生成有色络合物,正干扰:生成无色络合物,负干扰 干扰的消除 (1)制一定酸度,使干扰组分不生色。 (2)掩蔽剂,与干扰组分生成无色物。 (3)选择适当的波长。 (4)选择适当的参比液 (5)分离干扰组分 6.2.3测量波长和吸光度范围的选择 1.测量波长的选择 (1)“最大吸收原则":选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰(2)"吸收最大, 干扰最小”:在最大波长处有其他物质干扰时。如图6-7 2.吸光度范围的选择:A0.2-0.8(T为65%-15%)(相对误差较小) 6.2.4参比溶液的选择 1.M、L均无色,可用蒸馏水作参比 2.L无色,M有色,可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 3.L有色,M无色,可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4.L、M均有色,可将一份试液加λ适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与显色 剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比溶液 5.改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 625标准曲线的制作 配制一系列标准溶液,作A一c曲线,待测组分的含量可以从标准曲线上查出。 63光度分析法的误差 631对朗伯一比尔定律的偏离 1.非单色光 A领,1=104lm=b=l A=bc= lg 12=10-2beIo lotIon 1+12-10-4kb+10k1 若s1=E2,则A=Ebc,若1≠E2,A与c不成线性关系 2.介质不均匀引起的偏离 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 632吸光度测量的误差 光度分析的准确度,由仪器本身决定的,对一台仪器来说读数误差AT为定值。 定的△T,对应的△c不同,相对误差Δc/不同 小,Δ7引起的△c小,△c(大;c大,Δ起的Δc大,△c/大。 A=-lgT=0.434Int dA 0. 434dT dA 0.434dT 0.434dT T a T(-1gT) TlgT 相对误差:RE=C=4=4=0434 c AA TlgT
6－3 4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如 Cu(SCN)4 2－在水 中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。 6．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除： （1） 制一定酸度，使干扰组分不生色。 （2） 掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。 （3） 选择适当的波长。 （4） 选择适当的参比液 （5） 分离干扰组分 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1．测量波长的选择 (1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大， 干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图 6－7 2. 吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T 为 65%-15%）(相对误差较小) 6.2.4 参比溶液的选择 1．M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。 2. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 3. L 有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4．L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色 剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。 5．改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。 6.2.5 标准曲线的制作 配制一系列标准溶液，作 A－c 曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。 6.3 光度分析法的误差 6.3.1 对朗伯－比尔定律的偏离 1．非单色光 1 2 1 2 01 02 1 1 01 2 2 2 02 1 2 01 02 01 02 1 2 01 02 lg , 10 lg , 10 A lg lg A A c 10 10 bc bc bc bc I I A bc I I A bc I I I I I I I I I I I I − − − − = = = = = = 1 2 1 2 ＋ ＋ ＝ ＝ 若 ＝ ，则 ＝ bc,若 ， 与 不成线性关系 ＋ ＋ 2．介质不均匀引起的偏离 3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2 吸光度测量的误差 光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差T 为定值。 一定的ΔT，对应的Δc不同，相对误差Δc/c不同。 c小，ΔT引起的Δc小，Δc/c大；c大，ΔT引起的Δc大，Δc/c大。 0.434dT dA 0.434dT 0.434dT A=-lgT=0.434lnT dA=- =- = T A T (-lgT) T lgT 相对误差： 0.434 lg c A dA dT RE c A A T T = = = =
6.4其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1.原理(高浓度示差吸光光度法) 选用比cx浓度稍小的c为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍 4=2→4m=A=A-4=(-)=bN=Ebcm,定量基础:△4=ab(-6)=bNc a先做△A~△c标准曲线;b.测待测溶液的△A:c从标准曲线查出相应的△c;dcx=co+△c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果:c±cx·x%,示差光度法结 果:c±(cn=co)x 642双波长吸光光度法 1.原理:当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法;广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2.应用:(1)混浊试液中组分的测定:(2)单组分的测定;(3)两组分共存时的分别测定 643酸(碱)高解常数的测定 H++ B 在某波长λ下,测量溶液吸光度(设酸HB和碱B均有吸收,液层厚度b=1cm)则 CHB H A=Eme [HB]+E8-[B-1=65ms K +/-*E k tH-1 HR-A A-A 644络合物组成的测定 (1)饱和法(又称摩尔比法) (2)连续变化法(又称等摩尔系列法) 固定一种组分(通常是金 cICRO,改变cM和cR的相对量, 属离子M)的浓度,改变络合 配制一系列溶液,在有色络合物 剂(R)的浓度,得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/[M]比值不同的溶液, 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 MRn浓度最大时,cPcM比值为n 参比液,分别测定其吸光度 当cMyc为0.5时,络合比为1:1 以吸光度A为纵坐标,[R]/[M为横坐标作图。 当cMc为0.33,络合比为1:2: .3 [RIM VMmL 0.0 1.0 2. 图6-16饱和法 /mL5.04 图6-17连续变化法 作业:P2a3,5,6P298,11,12P24015,17,19
6－4 6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 1．原理(高浓度示差吸光光度法) 选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 0 0 0 ( ) ( ) 0 0 , x x x x x A c b A A A A b c c b c bc A b c c b c A c b = = = − = − == = = − = = 相对 相对 定量基础： a.先做A~c 标准曲线；b.测待测溶液的A；c.从标准曲线查出相应的c；d.cx=c0+ c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x%普通光度法结果： c c x x x % ，示差光度法结 果： c c c x x x − ( 0 ) % 6.4.2 双波长吸光光度法 1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物 试样的分析 2．应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。 6.4.3 酸（碱）离解常数的测定 HB = H+ + B－ 在某波长下，测量溶液吸光度（设酸 HB 和碱 B －均有吸收，液层厚度 b=1cm）则 ( ) ( ) , lg HB HB a HB HB B B a a HB HB HB a B B B c H c K A HB B K H K H A A A c A c pK pH A A − − − − − + − + + = + = + + + − = = = − − 6.4.4 络合物组成的测定 （1）饱和法(又称摩尔比法) （2）连续变化法(又称等摩尔系列法) 固定一种组分(通常是金 cM+cR=c，改变 cM 和 cR 的相对量， 属离子 M)的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物 剂(R)的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 [R]/[M]比值不同的溶液， 溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 MRn 浓度最大时，cR/cM 比值为 n。 参比液，分别测定其吸光度。 当 cM/c 为 0.5 时，络合比为 1:1； 以吸光度 A 为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。 当 cM/c 为 0.33，络合比为 1:2； 作业：P238 3, 5, 6 P239 8, 11, 12 P240 15, 17, 19