第五节 层析法 又叫 凝胶过滤、凝胶层析、凝胶渗透层析、 排阻渗透层析、分子筛过滤等
第五节 层析法 又叫 凝胶过滤、凝胶层析、凝胶渗透层析、 排阻渗透层析、分子筛过滤等
◼ 一、凝胶层析的原理 ◼ 将具有分子大小网状结构（孔隙）的凝胶粒子浸渍于某种溶液 中时，溶液中的溶质分子凡是比网络孔隙小的都能自由进入凝胶粒子 内，大的分子由于不能潜入网格便残留在溶液中，所以将分子大小不 同的溶液（如蛋白质和硫酸铵）加入到分离柱中，只有小分子物质 （硫酸铵）完全能进入凝胶粒子内，而大分子（蛋白质）则被排阻于 粒子外，彼此互相筛分，加入洗液后，溶液在分离柱内向下移动，先 流出的洗液中，全部含有大分子物质（蛋白质），后流出的洗液中含 有小分子物质（硫酸铵），从而达到分离和提纯的目的
◼ 一、凝胶层析的原理 ◼ 将具有分子大小网状结构（孔隙）的凝胶粒子浸渍于某种溶液 中时，溶液中的溶质分子凡是比网络孔隙小的都能自由进入凝胶粒子 内，大的分子由于不能潜入网格便残留在溶液中，所以将分子大小不 同的溶液（如蛋白质和硫酸铵）加入到分离柱中，只有小分子物质 （硫酸铵）完全能进入凝胶粒子内，而大分子（蛋白质）则被排阻于 粒子外，彼此互相筛分，加入洗液后，溶液在分离柱内向下移动，先 流出的洗液中，全部含有大分子物质（蛋白质），后流出的洗液中含 有小分子物质（硫酸铵），从而达到分离和提纯的目的
◼ 二、 凝胶层析法常用的凝胶 ◼ 1、天然凝胶 ◼ 琼脂和琼脂糖凝胶 （Sepharose）：能分离较大相对分 子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高 离子强度的洗脱液 ◼ 2、人工合成凝胶 ◼ （1）聚丙稀酰胺凝胶（Bio－Gel P） ◼ （2）交联葡聚糖凝胶（Sephedex）
◼ 二、 凝胶层析法常用的凝胶 ◼ 1、天然凝胶 ◼ 琼脂和琼脂糖凝胶 （Sepharose）：能分离较大相对分 子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高 离子强度的洗脱液 ◼ 2、人工合成凝胶 ◼ （1）聚丙稀酰胺凝胶（Bio－Gel P） ◼ （2）交联葡聚糖凝胶（Sephedex）
◼ 三、凝胶层离技术 ◼ 1、凝胶柱的制备 ◼ （1）凝胶的预处理 ◼ （2）凝胶的装填 ◼ （3）层析床的检查 ◼ （4）柱的平衡 ◼ 2、样品和洗脱剂的准备 ◼ 洗脱剂：试剂是分析纯、水是纯水 ◼ 固体样品溶于洗脱剂中，无颗粒
◼ 三、凝胶层离技术 ◼ 1、凝胶柱的制备 ◼ （1）凝胶的预处理 ◼ （2）凝胶的装填 ◼ （3）层析床的检查 ◼ （4）柱的平衡 ◼ 2、样品和洗脱剂的准备 ◼ 洗脱剂：试剂是分析纯、水是纯水 ◼ 固体样品溶于洗脱剂中，无颗粒
◼ 3、加样 ◼ （1）加样量的选择 ◼ 脱盐、缓冲液交换等组分分离时加样体积为床体积的30％，如果要求较高的 回收率，则为15％～20％。 ◼ （2）加样方法和注意事项 ◼ 进样器或注射器 ◼ 排干法 ◼ 液面下加样 ◼ 4、洗脱技术 ◼ 洗脱流速 高速 涡流扩散严重，导致区带变宽
◼ 3、加样 ◼ （1）加样量的选择 ◼ 脱盐、缓冲液交换等组分分离时加样体积为床体积的30％，如果要求较高的 回收率，则为15％～20％。 ◼ （2）加样方法和注意事项 ◼ 进样器或注射器 ◼ 排干法 ◼ 液面下加样 ◼ 4、洗脱技术 ◼ 洗脱流速 高速 涡流扩散严重，导致区带变宽
◼ 5、样品的检测、收集和处理 ◼ 6、凝胶过滤介质的再生、清洗和储存 ◼ 再生：用1.5～2个柱体积的洗脱剂完成洗脱过程 ◼ 清洗：碱液清洗（0.1～0.5moL/L的NaOH）、乙醇、非离子型去污剂 ◼ 保存： 浸泡在抑菌剂的溶液中，比如：20％乙醇、0.02％～0.05％的 叠氮化钠、0.01moL/L的NaOH，0.05％的三氯丁醇，0.01～0.02％的可 乐酮
◼ 5、样品的检测、收集和处理 ◼ 6、凝胶过滤介质的再生、清洗和储存 ◼ 再生：用1.5～2个柱体积的洗脱剂完成洗脱过程 ◼ 清洗：碱液清洗（0.1～0.5moL/L的NaOH）、乙醇、非离子型去污剂 ◼ 保存： 浸泡在抑菌剂的溶液中，比如：20％乙醇、0.02％～0.05％的 叠氮化钠、0.01moL/L的NaOH，0.05％的三氯丁醇，0.01～0.02％的可 乐酮
不锈钢层析柱 四、层离设备 1.分离柱 2.恒压储液瓶 3.恒流泵 4.洗脱液收集器 5.恒温设备
不锈钢层析柱 四、层离设备 1.分离柱 2.恒压储液瓶 3.恒流泵 4.洗脱液收集器 5.恒温设备
五、凝胶层析法在发酵中的应用 ◼ 1、脱盐 ◼ 2、凝胶层析法去除热源物质 ◼ 3、凝胶浓缩高分子溶液 ◼ 4、测定高分子物质的相对分子质量 ◼ 5、分析
五、凝胶层析法在发酵中的应用 ◼ 1、脱盐 ◼ 2、凝胶层析法去除热源物质 ◼ 3、凝胶浓缩高分子溶液 ◼ 4、测定高分子物质的相对分子质量 ◼ 5、分析