中华人民共和国国家标准 GB 4789.4—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 National food safety standard Food microbiological examination：Salmonella.pdf_大学文库

GB4789.4-2010 无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36C±！℃培养8h~ 18h。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min,或2℃一5℃不超过18h解冻。 5.2增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10 mLTTB内，于42℃±1℃培养18h一24 h。同时，另取1mL,转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h~24h. 5.3分离分别用接种环取增南液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于36℃±1℃分别培养18h~24h(X1D琼、HE琼脂平板、沙门氏茵属显色培养基平板)或40h~48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板少门氏菌 BS琼脂南落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色：有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数南落中心黑色或几乎全黑色：有些黄株为黄色，中心黑色或机平全里佰 XLD琼脂菌落星粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可孕现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落：有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心，沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。 5.4生化试验 5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线再于底层穿刺：接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃ 培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁球脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2 表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧南试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢可疑沙门氏菌属 A 十（一 +(一可疑沙门氏南屈 A A +(一) +(一) + 可疑沙门氏南属 +/- 非沙门氏 +1 非沙门氏菌注：K:产碱，A:产酸：十：阳性，一：阴性：十（一）：多数阳性，少数阴性：十/一：阳性或阴性。 5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查

GB 4789.4—2010 4 无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。 5.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 5.3 分离分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或 40 h～48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌 BS 琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE 琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD 琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。 5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂初步判断斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶试验培养基 K A ＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属 K A ＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属 A A ＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属 A A ＋/－＋/－－非沙门氏菌 K K ＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查

GB 4789.4—2010 5 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质 pH 7.2 尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶 A1 ＋－－－＋ A2 ＋＋－－＋ A3 －－－－＋/－注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。如有 2 项异常为非沙门氏菌。表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋表示阳性；＋表示阴性。 5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ ONPG －－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－ KCN －－－＋＋－注：＋表示阳性; －表示阴性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 2％～3％）培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰

GB4789.4-2010 上煮沸后再检查。H抗原发有不良时，将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查：或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次一2 次，自远端取茵培养后再拾查 5.5.2多价菌体抗原(0)鉴定在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放12环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的茵落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1mi,并对者黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3多价鞭毛抗原(H)鉴定同5.52。 5.5.4血洁学分型（选做项目】 5.5.4.10抗原的鉴定用A~F多价0血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被AP多价0血清凝集者，依次用O4:O3、010：07:O8:O9:O2和O11因子血清做凝里试验。根据试验结果，判定0群。被O3、010血清凝集的菌株，再用010、O15、034、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个0抗原成分的最后确定均应根据0单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被A一F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，测用这种血清所包括的0群血清逐一检查，以确定0群。每种多价0血清所包括的0因子如下： 0老份 A,B,C,D,E,E,群（并包括6,14群 0多价213,16,17,18,21群 0多价328,30,35,38,39群 0多价440,41,42,43群 0多价5 44,45,47,48看 0多价650,51,52,53群 0多价755,56,57,58群 0多价859,60.61,62群 0多价9 63,65,66,67群 5.5.4.2H抗原的鉴定属于A~F各0群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。表6A一F群常见菌型H抗原表 0群第1相第2相 B gfs B ibd CI k.vrc 5z15 2 D(不产气的 D(产气的》 8.m.p.q 无无 h.v 6.x E4 g.st 无 E4

GB 4789.4—2010 6 上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1 次～2 次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同 5.5.2。 5.5.4 血清学分型（选做项目） 5.5.4.1 O 抗原的鉴定用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被 A～F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。不被 A～F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下： O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群（并包括 6,14 群） O 多价 2 13，16，17，18，21 群 O 多价 3 28，30，35，38，39 群 O 多价 4 40，41，42，43 群 O 多价 5 44，45，47，48 群 O 多价 6 50，51，52，53 群 O 多价 7 55，56，57，58 群 O 多价 8 59，60，61，62 群 O 多价 9 63，65，66，67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定属于 A～F 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。表 6 A～F 群常见菌型 H 抗原表 O 群第 1 相第 2 相 A B B C1 C2 D（不产气的） D（产气的） E1 E4 E4 a g,f,s i,b,d k,v,r,c b,d,r d g,m,p,q h,v g,s,t i 无无 2 5,z15 2,5 无无 6,w,x 无

GB4789.4-2010 不常见的南型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H 因子如下： H多价1 a,b.c,d.i H多价2 eh,enx,enzis,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gzs H多价3kr,y,z,Z0,w,w,lz3,2g,lZ4o H多价41,2：1,5：1,6：1,7：26 H多价5 7423742247422729235,736Z3w H多价6 Z39,Z41,Z42,Z44 H多价7Z5,Z53,Z4,Z55 H多价8Z5,Z1,Z0,Z1,Z 每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1一2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相弯异拾查位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管约1L-2L)在西精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H 因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁团湿棉花，防琼脂中水分蒸发而每天检查结果，待另相细菌解离后可以从挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1：200~1：800的量加入。小倒管法：将两瑞开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检南株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。简易平板法将0.35%~0.4%半周体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半周体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 5.5.4.3Vi抗原的鉴定用因子血清检查。已知具有V抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副剧伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。 5.5.4.4菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。 6结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌

GB 4789.4—2010 7 不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查，以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下： H 多价 1 a，b，c，d，i H 多价 2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51 H 多价 3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40 H 多价 4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6 H 多价 5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38 H 多价 6 z39，z41，z42，z44 H 多价 7 z52，z53，z54，z55 H 多价 8 z56，z57，z60，z61，z62 每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果，没有 H 单因子血清的要用两个 H 复合因子血清进行核对。检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可在琼脂斜面上移种 1～2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管约 1 mL～2 mL）在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃，取已知相的 H 因子血清 0.05 mL～0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清 1：200～1：800 的量加入。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ℃，挑取因子血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种 1％软琼脂斜面，于 37 ℃培养后再做凝集试验。简易平板法：将 0.35％～0.4％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。 5.5.4.4 菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。 6 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌

中华人民共和国国家标准 GB 4789.4—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 National food safety standard Food microbiological examination：Salmonella

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