第七章 动物基因工程
第七章 动物基因工程
第一节基因工程概述 基因工程( Genetic engineering)是一种DNA重组技术,它 是在分子水平上进行的遗传操作,即把供体细胞中的 基因或基因组提取出来,按照预先设计的蓝图,经过 体外加工重组,或者把人工合成的基因转移到受体细 胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必 须与载体DNA重组后才能实现转移,所以基因工程也 叫做重组DNA技术。 基因工程的基本操作程序包括:(1)目的基因的分离或合 成;(2)用工具酶对目的基因和载体( Vector)进行加 工处理,把目的基因与载体结合成重组DNA分子;(3) 把重组DNA分子引入受体细胞,并使目的基因和载体 上其他基因得以表达;(4)转化体细胞的扩增;(5) 重组体细胞的鉴定与筛选
第一节 基因工程概述 基因工程(Genetic engineering)是一种DNA重组技术，它 是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的 基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过 体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细 胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必 须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也 叫做重组DNA技术。 基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分离或合 成；(2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加 工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3) 把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体 上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5） 重组体细胞的鉴定与筛选
基因克隆示意图 载体DNA 限制性内切酶切开) 目的基因 重组体 宿主细胞 已转化的宿主细胞 繁殖 阳性克隆株 表达
• 基因克隆示意图 目的基因 载体DNA (限制性内切酶切开) 重组体 宿主细胞 已转化的宿主细胞 繁殖 阳性克隆株 表达
常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′-5磷酸二酯键 DNA聚合酶I探针标记、补平3末端 反转录酶 CDNA合成 多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记 末端转移酶 3末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
第二节 工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 常用的工具酶
限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 识别特异的位点一酶切位点 回文结构4~6bp ECoRI 出现两种末端 GAATTC CTTAAG 粘性末端粘端 平头末端平端 Smal I --CCCGGG 配伍末端 --GGGCCC-
限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶 甲基化酶 识别特异的位点—酶切位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 配伍末端 GAATTC CTTAAG Eco RⅠ CCCGGG GGGCCC Smal Ⅰ
二、DNA聚合酶 (-)DNA聚合酶I(全酶)(E. coli DNA Polymease (二) Klenow片段(E,coli (三)T4DNA聚合酶(T噬茵体感染的E.coli (四) Taq dna聚合酶( Thermusagraticus) (五)逆转录酶( reverse transcriptase) (六)末端转移酶
二、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶I(全酶) (E. coli DNA Polymease) （二）K1enow片段(E.co1i) （三）T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的E．co1i) （四）Taq DNA聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆转录酶（reverse transcriptase） （六）末端转移酶
三、DNA遵接酶 在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶,这种酶能够催 化DNA中相邻的3’—OH和5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键 连接反应的最适温度是37℃,但在此温度下粘性末端之间氢键结 合很不稳定。实验表明,15℃对于连接反应和粘性末端氢键结合 的稳定性都是合适的。 四、甲基化酶 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶( methylase) 米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序 甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化,保护DNA不被限 制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶QM5C)
三、DNA连接酶 在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催 化DNA中相邻的 3’一OH和5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。 连接反应的最适温度是37℃，但在此温度下粘性末端之间氢键结 合很不稳定。实验表明，15℃对于连接反应和粘性末端氢键结合 的稳定性都是合适的。 四、甲基化酶 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase) 米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。 甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限 制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)
五、核酸酶 (一)核酸酶S1( Nuclease s1) 核酸酶S主要用于:(1)分析DNA:RNA杂交体结构。通过降解成熟 mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。(2)切除 DNA片段上的单链末端,形成平末端。(3)切开cDNA合成过程中形成的 发夹环。(4)在限制酶位点上产生小缺失。 (二)核酸外切酶II (三)核酸外切酶VI (四)DNA酶I (五)RNA酶A(牛胰) (六)RNA酶T (七)RNA酶H
五、核酸酶 （一）核酸酶S1 (Nuclease S1 ) 核酸酶S1主要用于：(1)分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟 mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。 (2)切除 DNA片段上的单链末端，形成平末端。(3)切开cDNA合成过程中形成的 发夹环。 (4)在限制酶位点上产生小缺失。 (二)核酸外切酶III （三）核酸外切酶VII （四）DNA酶I （五）RNA酶A (牛胰) （六）RNA酶TI （七）RNA酶H
第三节基因工程的载体 Vector) 到目前为止,用于基因工程的载体有8类 ①细菌质粒载体;包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。 ②λ噬菌体衍生载体。 ③柯斯质粒( Cosmid载体:一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建 的复合载体。 ④噬菌体M3衍生载体一类专门用于 Sanger法测序的载体。 ⑤Phag9m5d载体:一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合 载体。 ⑥酵母质粒载体:由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。 ⑦真核病毒载体:包括动物病毒、植物病毒衍生载体。 ⑧杆状病毒和 Bacmid载体;
第三节基因工程的载体 （Vector） • 到目前为止，用于基因工程的载体有8类： • ① 细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。 • ② λ噬菌体衍生载体。 • ③ 柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建 • 的复合载体。 • ④ 噬菌体M13衍生载体一类专门用于Sanger法测序的载体。 • ⑤ Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合 • 载体。 • ⑥ 酵母质粒载体：由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。 • ⑦ 真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。 • ⑧ 杆状病毒和Bacmid载体；
作为基因工程的载体它们都具备以下一些 共同的基本特点: 作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同 的基本特点: ①在宿主细胞中能独立自主地复制。 ②表达载体含有强启动于,能驱动靶基因在宿 主细胞中表达。 ③容易从宿主细胞中分离纯化。 ④载体DNA基因组中有一段不影响它们复制 的非必需区域,插在其中的靶片段能被动地 跟着载体DNA一起复制,就像载体的正常成 分一样
作为基因工程的载体它们都具备以下一些 共同的基本特点： 作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同 的基本特点： ① 在宿主细胞中能独立自主地复制。 ② 表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿 主细胞中表达。 ③ 容易从宿主细胞中分离纯化。 ④ 载体DNA基因组中有一段不影响它们复制 的非必需区域，插在其中的靶片段能被动地 跟着载体DNA一起复制，就像载体的正常成 分一样