第八章外源基因表达产物的分离纯化 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 二常用的分离方法 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 四重组蛋白质的鉴定
四 重组蛋白质的鉴定 三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 二 常用的分离方法 一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 第八章 外源基因表达产物的分离纯化
、重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 ●分离纯化过程的规模化
一、 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
1.针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体; 采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选用亲和层析 进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶菌酶处理,然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白
1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用 沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析 进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然 后再用渗透压休克法释放重组蛋白
2.针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类 开 等电点处于极端区域(pl≤5或p8)的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白; 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的;
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类 等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI型≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分 离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
3.多种分离纯化技术的联合运用 在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 ○应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
3. 多种分离纯化技术的联合运用 在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4.合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有 Sephadex和 Superose。 理想的分离纯化介质应具有下列性质: 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 ○化学性能和机械性能稳定,重复性好 价格低廉
4. 合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。 理想的分离纯化介质应具有下列性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉
Sephadex是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联 形成的三维网状凝胶颗杓 Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经 过两次交联后得到的
• Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联 形成的三维网状凝胶颗粒 • Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经 过两次交联后得到的
5.分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适 如 实验室方法在工程上可能难以实现(超声波破细胞壁) ○实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心 因此,在很多情况下,实验室的技术路线不等于生产工艺
5. 分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适， 如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺
二、常用的分离方法 1.离子交换层析 离子交换层析的基本原 离子交换介质的基水性 篱子交换介质的选择原 留子交换层析的基本操 作
1. 离子交换层析 二、常用的分离方法 离子交换层析的基本原 理离子交换介质的基本性 质 离子交换层析的基本操 作 离子交换介质的选择原 则
离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子溶液为流动相,利 用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异,而将混合物进行分离的层析技 术
离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利 用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技 术