《酶工程》教案 甘肃农业大学生命科学技术学院 2016年9月
《酶工程》教案 甘肃农业大学生命科学技术学院 2016 年 9 月
酶工程教案 本课程的主要内容有:绪论、酶的基本性质、酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶与细胞 固定化、酶反应器、酶的应用。 第一章绪论(2学时) (一)教学目的与要求: 学习目的要求:通过教学使学生了解酶学与酶工程的概念:掌握酶学与酶工程研究的主要内容以及酶学研 究的历史与现状,明确酶学与酶工程研究的重要意义 (二)教学的重点与难点分析: 重点:酶工程的概念、酶工程研究的主要内容 难点:生物酶工程的研究内容 三)教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问 (四)教学内容: 国内外酶制剂生产和应用现状 1、世界三大酶制剂公司 2、我国酶工业发展阶段 、酶与酶工程发展简史 1、酶学研究简史 2、酶学理论研究 3、酶工程研究简史 酶工程的概念和酶工程研究的主要内容 酶工程( Enzyme Engineering):从应用目的出发,研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶 的各方面应用。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学,是酶学、微生物学的基本原理与 化学工程有机结合而产生的边缘科学 酶工程的内容包括酶的生产、改性与应用 四、酶学与酶工程研究的重要意义 五、酶工程的学习方法 第二章藤的基本性质(2学时) (一)教学目的与要求: 学习目的要求:通过教学使学生了解酶的分类命名原则和六大酶类及其主要特点;掌握酶作为生物催化剂 的特点,清晰 Koshland对酶分子中氨基酸残基的功能类型分类,以及酶促反应动力学 (二)教学的重点与难点分析: 重点:六大酶类及其催化性质,酶活力测定的步骤和酶活力及表示法以及酶的生产方法 难点:酶分子中氨基酸残基的功能类型,酶活力测定的步骤和酶活力及表示法。 (三)教学方法、手段
2 酶工程教案 本课程的主要内容有：绪论、酶的基本性质、酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶与细胞 固定化、酶反应器、酶的应用。 第一章 绪论（2 学时） （一）教学目的与要求： 学习目的要求：通过教学使学生了解酶学与酶工程的概念；掌握酶学与酶工程研究的主要内容以及酶学研 究的历史与现状，明确酶学与酶工程研究的重要意义。 （二）教学的重点与难点分析： 重点：酶工程的概念、酶工程研究的主要内容。 难点：生物酶工程的研究内容。 （三）教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问 （四）教学内容： 一、国内外酶制剂生产和应用现状 1、世界三大酶制剂公司 2、我国酶工业发展阶段 二、 酶与酶工程发展简史 1、酶学研究简史 2、 酶学理论研究 3、 酶工程研究简史 三、酶工程的概念和酶工程研究的主要内容 酶工程（ Enzyme Engineering）：从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶 的各方面应用。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与 化学工程有机结合而产生的边缘科学。 酶工程的内容包括酶的生产、改性与应用 四、酶学与酶工程研究的重要意义 五、酶工程的学习方法 第二章 酶的基本性质（2 学时） （一）教学目的与要求： 学习目的要求：通过教学使学生了解酶的分类命名原则和六大酶类及其主要特点；掌握酶作为生物催化剂 的特点，清晰 Koshland 对酶分子中氨基酸残基的功能类型分类，以及酶促反应动力学。 （二）教学的重点与难点分析： 重点：六大酶类及其催化性质，酶活力测定的步骤和酶活力及表示法以及酶的生产方法。 难点：酶分子中氨基酸残基的功能类型，酶活力测定的步骤和酶活力及表示法。 （三）教学方法、手段
多媒体课件辅以板书、提问 (四)教学内容: 第一节酶的概念 酶的化学本质 具有生物催化功能的生物大分子,按照其化学组成,可以分为蛋白类酶(P酶)和核酸类酶(R酶)两 大类别。 二、酶的分子组成单纯酶,结合酶 .酶的催化特点 1酶催化作用的专一性强 2酶催化作用的效率高 3酶催化作用的条件温和 第二节酶的作用机制 酶的活性中心 称活性部位( active site),指必需基团在空间结构上彼此靠近,组成具有特定空间结构的区域,能与 底物特异结合并将底物转化为产物 酶促反应的机理 第三节影响酶催化作用的因素 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、p值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。 、底物浓度的影响 底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。在其他条件不变的情况下,酶催化反应速度与底物浓度 的关系 在底物浓度较低的情况下,酶催化反应速度与底物浓度成正比,反应速度随着底物浓度的增加而加快。 当底物浓度达到一定的数值时,反应速度的上升不再与底物浓度成正比,而是逐步趋向平衡。 Vea[s] 著名的米氏方程 酶浓度的影响 在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比,之间的关系可以用下式表示:V=k[E] 温度的影响 每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围和最适温度 四、pH值的影响 酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系 每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适p值。 五、抑制剂的影响 酶的抑制剂:使酶的催化活性降低或者丧失的物质 抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。 不可逆抑制剂:与酶分子结合后,抑制剂难于除去,酶活性不能恢复。 可逆性抑制剂:与酶的结合是可逆的,只要将抑制剂除去,酶活性即可恢复。 根据可逆性抑制作用的机理不同,酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争 性抑制三种 竞争性抑制( competitive inhibition):指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用 非竞争性抑制( noncompetitive inhibition):指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合,而 引起酶活性降低的抑制作用
3 多媒体课件辅以板书、提问 （四）教学内容： 第一节 酶的概念 一. 酶的化学本质 具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P 酶）和核酸类酶（R 酶）两 大类别。 二、 酶的分子组成 单纯酶，结合酶 三. 酶的催化特点 1 酶催化作用的专一性强 2 酶催化作用的效率高 3 酶催化作用的条件温和 第二节 酶的作用机制 一、 酶的活性中心 称活性部位(active site)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与 底物特异结合并将底物转化为产物。 二、 酶促反应的机理 第三节 影响酶催化作用的因素 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH 值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。 一、底物浓度的影响 底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。在其他条件不变的情况下，酶催化反应速度与底物浓度 的关系 在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。 当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。 著名的米氏方程: 二、酶浓度的影响 在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比，之间的关系可以用下式表示：V = k [E] 三、温度的影响 每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围 和最适温度。 四、 pH 值的影响 酶的催化作用与反应液的 pH 值有很大关系。 每一种酶都有其各自的适宜 pH 值范围和最适 pH 值。 五、 抑制剂的影响 酶的抑制剂：使酶的催化活性降低或者丧失的物质。 抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。 不可逆抑制剂：与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。 可逆性抑制剂：与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。 根据可逆性抑制作用的机理不同， 酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争 性抑制三种。 竞争性抑制（competitive inhibition）：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。 非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而 引起酶活性降低的抑制作用
反竞争性抑制( uncompetitive inhibition):在底物与酶分子结合生成中间复合物后,抑制剂再与中 间复合物结合而引起的抑制作用。 六、激活剂的影响 酶的激活剂或活化剂:能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。 第四节酶的分类命名原则 酶的国际系统命名法、习惯命名法。 六大酶类类及其主要特点 、氧化还原酶类、 移酶类 三、水解酶类 四、解合酶类、 五、异构酶类 六、合成酶类 第六节酶的活力测定 酶活力测定方法和酶活力测定的步骤 酶活力及表示法 、酶活力单位:在标准条件(25℃、最适p、最适底物浓度)下一分钟内催化1μmol底物所需的酶量 为一个酶活力单位,及国际单位IU 、比活力:每毫克蛋白质所含的酶,表示酶的纯度 四、酶的转换数Kcat:当酶被底物充分饱和时,单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 第六节酶的生产方法 提取分离法:提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生 物细胞中将酶提取出来,再进行分离纯化的技术过程。 生物合成法 据所使用的细胞种类不同,生物合成法可以分为微生物发酵产酶,植物细胞培养产酶和动物细胞培养 产酶。自从1949年细菌α一淀粉酶发酵成功以来,生物合成法就成为酶的主要生产方法 三、化学合成法化学合成法是采用合成仪进行酶的化学合成,成本高,难以工业化生产。 第三章酶的发酵生产(6学时) (一)教学目的与要求 学习目的与要求:通过教学使学生掌握常用的产酶微生物种类、菌种的分离、富集和选育过程,学习了解产 酶调节机制:熟悉微生物发酵产酶的工艺流程及其具体环节。明确酶生物合成的模式、特点及原因,了解 酶生物合成动力学方程。 (二)教学的重点与难点分析: 重点:产酶调节机制和酶的发酵工艺条件及控制等 难点:产酶调节机制,影响酶生产的工艺条件和酶生物合成动力学方程等 (三)教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问
4 反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)：在底物与酶分子结合生成中间复合物后， 抑制剂再与中 间复合物结合而引起的抑制作用。 六、激活剂的影响 酶的激活剂或活化剂：能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。 第四节 酶的分类命名原则 酶的国际系统命名法、习惯命名法。 六大酶类类及其主要特点 一、氧化还原酶类、 二、移酶类、 三、水解酶类、 四、解合酶类、 五、异构酶类、 六、合成酶类 第六节 酶的活力测定 酶活力测定方法和酶活力测定的步骤： 一、酶活力及表示法 二、酶活力单位：在标准条件（25 ℃、最适 pH、最适底物浓度）下一分钟内催化 1 mol 底物所需的酶量 为一个酶活力单位，及国际单位 IU 三、比活力：每毫克蛋白质所含的酶，表示酶的纯度 四、酶的转换数 Kcat：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 第六节 酶的生产方法 一、提取分离法：提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生 物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。 二、生物合成法 据所使用的细胞种类不同，生物合成法可以分为微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶和动物细胞培养 产酶。自从 1949 年细菌α- 淀粉酶发酵成功以来，生物合成法就成为酶的主要生产方法。 三、化学合成法 化学合成法是采用合成仪进行酶的化学合成,成本高,难以工业化生产。 第三章 酶的发酵生产（6 学时） （一）教学目的与要求： 学习目的与要求: 通过教学使学生掌握常用的产酶微生物种类、菌种的分离、富集和选育过程，学习了解产 酶调节机制；熟悉微生物发酵产酶的工艺流程及其具体环节。明确酶生物合成的模式、特点及原因，了解 酶生物合成动力学方程。 （二）教学的重点与难点分析： 重点：产酶调节机制和酶的发酵工艺条件及控制等。 难点：产酶调节机制，影响酶生产的工艺条件和酶生物合成动力学方程等。 （三）教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问
(四)教学内容: 第一节酶的生物合成过程 酶生物合成的基本理论 蛋白类酶和核酸类酶→酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程 合成过程:酶的基因(DNA)→(转录)→RNA→(翻译)→多肽链→(加工、组装)蛋白质 1、RNA的生物合成一转录(参考相应的生物化学与分子生物学课程知识) 2、蛋白质的生物合成一翻译(参考相应的生物化学与分子生物学课程知识) 3、酶生物合成的调节 组成型酶( Constitutive enzyme):生物细胞中合成的酶的量比较恒定,这些酶的合成速率影响不大 如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。 适应型酶( Adaptive enzyme)或调节型酶( Regulated enzyme):生物细胞中合成的酶的含量却变化 很大,其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶, 生物体为了适应环境的变化,使代谢过程有条不紊地进行,需要根据各种条件的变化,对各种适应型 酶的生物合成进行调节控制。 ◇转录水平的调节 ◇转录产物的加工调节 ◇翻译水平的调节 ◇翻译产物的加工调节和酶降解的调节等 转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节 4、原核生物中酶生物合成的调节机制 原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节 雅各( Jacob)和莫诺德( Monod)于1960年提出的操纵子学说( Operon theory)来阐明的。 1)酶合成的诱导 某些代谢物可以诱导某些酶的合成,是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的,这种现象叫做 酶合成的诱导 2)分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物(碳源或氮源)存在时,利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物 的有关酶合成的现象 3)酶生物合成的反馈阻遏作用 又称产物阻遏作用,是指酶催化反应产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象 第二节常用的产酶微生物 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2)容易培养和管理 ③3)产酶稳定性好 (4)利于酶的分离纯化 (5)安全可靠,无毒性 产酶微生物:细菌、放线菌、霉菌、酵母等。 1、大肠杆菌,是最为著名的原核生物 应用:大肠杄菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖。大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿 主菌。工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备Asp、Thr及Val等。 2、醋酸杆菌(Acε aerobacter)应用:有机酸(食醋等)葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C中间体)
5 （四）教学内容： 第一节 酶的生物合成过程 一、 酶生物合成的基本理论 蛋白类酶和核酸类酶→酶的生物合成主要是指细胞内 RNA 和蛋白质的合成过程 合成过程:酶的基因（DNA）→（转录）→RNA →（翻译）→多肽链→（加工、组装）蛋白质 1、 RNA 的生物合成—转录（参考相应的生物化学与分子生物学课程知识） 2、 蛋白质的生物合成—翻译（参考相应的生物化学与分子生物学课程知识） 3、酶生物合成的调节 组成型酶（Constitutive enzyme）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率影响不大。 如 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。 适应型酶（Adaptive enzyme）或调节型酶（Regulated enzyme）：生物细胞中合成的酶的含量却变化 很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶。 生物体为了适应环境的变化，使代谢过程有条不紊地进行，需要根据各种条件的变化，对各种适应型 酶的生物合成进行调节控制。 ◇转录水平的调节 ◇转录产物的加工调节 ◇翻译水平的调节 ◇翻译产物的加工调节和酶降解的调节等 转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节 4、原核生物中酶生物合成的调节机制 原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节 雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于 1960 年提出的操纵子学说（Operon theory）来阐明的。 1)酶合成的诱导 某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做 酶合成的诱导。 2)分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物 的有关酶合成的现象。 3)酶生物合成的反馈阻遏作用 又称产物阻遏作用，是指酶催化反应产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象 第二节 常用的产酶微生物 一、用于酶的生产的细胞必须具备几个条件： (1)酶的产量高 (2)容易培养和管理 (3)产酶稳定性好 (4)利于酶的分离纯化 (5)安全可靠，无毒性 二、产酶微生物: 细菌、放线菌、霉菌、酵母等。 1、 大肠杆菌，是最为著名的原核生物。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖。 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿 主菌。工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备 Asp、Thr 及 Val 等。 2、 醋酸杆菌（Acetobacter）应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维 C 中间体）
枯草芽孢杆菌(Bα cillus subtilis)枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5 -核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。 4、根霉( Rhizopus)代表种:米根霉、黑根霉等 应用:根霉能产生一些酶类,如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌 5、曲霉(4 spergillus))代表种:黑曲霉、黄曲霉 应用:是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、果胶酶)的菌种。生产有机酸 如柠檬酸、葡萄糖酸等)。农业上用作生产糖化饲料的菌种。 第三节、醵的发酵工艺条件与控制 细胞的活化、种子扩大培养、培养基(碳源、氮源、无机盐、生长因素和产酶促进剂等)、发酵方法 (固体培养法、液体培养法) 培养基培养基( medium)是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基的设计原则:1)选择适宜的营养物质2)营养物的浓度及配比合适 3)物理、化学条件适宜4羟经济节约5)精心设计、试验比较 任何培养基都应该具备微生物生长所需要,五大要素:碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 、发酵条件及控制 1、p值的控制不同的细胞,其生长繁殖的最适p值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值在中 性或碱性范围(pH6.5~8.0);霉菌和酵母的最适生长pH值为偏酸性(pH4~6);植物细胞生长的最适pH 值为5~6。 细胞发酵产酶的最适p值与生长最适p值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该 酶催化反应的最适p值。 有些细胞可以同时产生若干种酶,在生产过程中,通过控制培养基的p值,往往可以改变各种酶之间的产 量比例。 温度的调节控制 细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件。在一定的温度范围内,细胞才能正常生长、繁殖和 维持正常的新陈代谢。 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。例如,枯草杆菌的最适生长温度为34~37C,黑曲霉的最适 生长温度为28~32℃等。 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同,而且往往低于生长最适温度。这是由于 在较低的温度条件下,可以提高酶所对应的mRNA的稳定性,增加酶生物合成的延续时间,从而提高酶的产 量。但是细胞生长速度较慢。若温度太低,则由于代谢速度缓慢,反而降低酶的产量,延长发酵周期 3、溶解氧的调节控制 细胞必须获得充足的氧气,使从培养基中获得的能源物质(一般是指各种碳源)经过有氧降解而生成 大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。 在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧(一般通过供给无 菌空气来实现),使培养基中的溶解氧保持在一定的水平 三、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产,在发酵过程中的某个适宜的时机,添加适宜的诱导物,可以显著提高酶的产 量。诱导物一般可以分为3类:酶的作用底物,酶的催化反应产物和作用底物的类似物。 2、控制阻遏物的浓度 为了提高酶产量,必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用 阻遏作用根据其作用机理的不同,可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 ◇为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用,应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度
6 3、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’ -核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。 4、 根霉(Rhizopus) 代表种：米根霉、黑根霉等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌。 5、 曲霉(Aspergillus) 代表种：黑曲霉、黄曲霉 应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸 （如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。 第三节、 酶的发酵工艺条件与控制 细胞的活化、种子扩大培养、培养基（碳源、氮源、无机盐、生长因素和产酶促进剂等）、发酵方法 （固体培养法、液体培养法） 一、培养基 培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基的设计原则：1）选择适宜的营养物质 2）营养物的浓度及配比合适 3）物理、化学条件适宜 4)经济节约 5)精心设计、试验比较 任何培养基都应该具备微生物生长所需要, 五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 二、发酵条件及控制 1、pH 值的控制 不同的细胞，其生长繁殖的最适 pH 值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适 pH 值在中 性或碱性范围（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的最适生长 pH 值为偏酸性(pH4～6)；植物细胞生长的最适 pH 值为 5～6。 细胞发酵产酶的最适 pH 值与生长最适 pH 值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适 pH 值通常接近于该 酶催化反应的最适 pH 值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的 pH 值，往往可以改变各种酶之间的产 量比例。 2、温度的调节控制 细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件。在一定的温度范围内，细胞才能正常生长、繁殖和 维持正常的新陈代谢。 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为 34～37o C，黑曲霉的最适 生长温度为 28～32 o C 等。 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于 在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的 mRNA 的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产 量。但是细胞生长速度较慢。若温度太低，则由于代谢速度缓慢，反而降低酶的产量，延长发酵周期。 3、溶解氧的调节控制 细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成 大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量 ATP。 在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧（一般通过供给无 菌空气来实现），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。 三、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产 量。诱导物一般可以分为 3 类:酶的作用底物，酶的催化反应产物和作用底物的类似物。 2、控制阻遏物的浓度 为了提高酶产量，必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用。 阻遏作用根据其作用机理的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 ◇为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度
◇对于受代谢途径末端产物阻遏的酶,可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除 3、添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用,增加细胞的透过性,有利于胞外酶的分泌,从而提高酶的产量 表面活性剂离子型和非离子型两大类。其中,离子型表面活性剂又可以分为阳离子型、阴离子型和两 性离子型3种。将适量的非离子型表面活性剂,如吐温( Tween)、特里顿( Triton)等添加到培养基中, 可以加速胞外酶的分泌,而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,尤其是季胺型表面活性剂(如‘新洁而灭’等)是消毒剂, 对细胞的毒性较大,不能在酶的发酵生产中添加到培养基中 4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中,添加适宜 的产酶促进剂,往往可以显著提高酶的产量 第四节生产过程的动力学 细胞在一定条件下培养生长,其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。 、酶生物合成的模式 同步合成型,延续合成型,中期合成型和滞后合成型。 (1)同步合成型:酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细 胞生长速度紧密联系,又称为生长偶联型。 (2)延续合成型:酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合 成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶,也可以是诱导酶。 (3)中期合成型:该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的 生物合成也随着停止 (4).滞后合成型:此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积 累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 综上所述,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。 二、酶发酵动力学 酵动力学是研究发酵工程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响 规律的学科。发酵动力学包括:细胞生长动力学、产物生成动力学、基质消耗动力学 1)细胞生长动力学细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规 2)产酶动力学 产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼,研究群体细胞的产酶速率及其影响因素,这称为宏观产酶动 力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼,研究细胞中酶合成速率及其影响因素,这谓之微观 产酶动力学或称为结构动力学。 3)基质消耗动力学被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成、和维持细胞的正常新陈代谢三个方面 第四章酶的分离和纯化(8学时) (一)教学目的与要求: 学习目的与要求:通过教学使学生了解酶原材料的选择的基本原则,细胞破碎方法以及酶分离纯化的各种方 法原理,理解和思考酶提取过程中应注意的主要问题。重点掌握根据酶分子大小和轻重设计的酶的分离纯 化方法、根据酶的溶解度设计的分离方法、根据酶分子电荷多少和正负设计的分离方法,了解根据亲和性 设计的分离方法和根据吸附性设计的分离方法。掌握酶的结晶、浓缩与干燥的基本原理与方法。 (二)教学的重点与难点分析:
7 ◇对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 3、添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 表面活性剂离子型和非离子型两大类。其中，离子型表面活性剂又可以分为阳离子型、阴离子型和两 性离子型 3 种。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿（Triton）等添加到培养基中， 可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂， 对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜 的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。 第四节 酶生产过程的动力学 细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等 4 个阶段。 一、 酶生物合成的模式 同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。 (1)同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细 胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型。 (2)延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合 成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。 (3)中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的 生物合成也随着停止。 (4)．滞后合成型：此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积 累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 综上所述，酶所对应的 mRNA 的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。 二、酶发酵动力学 酵动力学是研究发酵工程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响 规律的学科。发酵动力学包括：细胞生长动力学、产物生成动力学、基质消耗动力学 1）细胞生长动力学 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规 律。 2）产酶动力学 产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动 力学或这称为非结构动力学。 也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观 产酶动力学或称为结构动力学。 3）基质消耗动力学 被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成、和维持细胞的正常新陈代谢三个方面 第四章 酶的分离和纯化（8 学时） （一）教学目的与要求： 学习目的与要求: 通过教学使学生了解酶原材料的选择的基本原则，细胞破碎方法以及酶分离纯化的各种方 法原理，理解和思考酶提取过程中应注意的主要问题。重点掌握根据酶分子大小和轻重设计的酶的分离纯 化方法、根据酶的溶解度设计的分离方法、根据酶分子电荷多少和正负设计的分离方法，了解根据亲和性 设计的分离方法和根据吸附性设计的分离方法。掌握酶的结晶、浓缩与干燥的基本原理与方法。 （二）教学的重点与难点分析：
重点:酶提取过程中应注意的主要问题、各种酶的分离纯化方法 难点:凝胶过滤法的原理、亲和层析的原理和大规模电泳的方法原理以及酶分离纯化的策略。 (三)教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问 (四)教学内容: 第一节细胞破碎 、酶原材料的选择: 二、细胞破碎方法:机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶学破碎法。 机械破碎法 捣碎法 通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。 研磨法 浆法 物理破碎法 温度差破碎法 通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结 压力差破碎法 构破坏,而使细胞破碎, 超声波破碎法 化学破碎法 添加有机溶剂 通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎 添加表面活性剂 酶促破碎法 自溶法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使 外加酶制剂法 细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎 第二节酶的提取 、酶提取的主要方法:酸抽提、碱抽提、盐抽提和有机溶剂抽提 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.02~0.5m0l/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取 PH2~6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大,且稳定性较好的酶 溶液提取 PH8~12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂提 可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 二、酶提取过程中应注意的主要问题。 主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外,还受到温度、p值、提取液体积等提取条件的影响。 第三节酶的分离纯化方法 、沉淀分离 根据酶的溶解度设计的分离方法,包括盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合 物沉淀法 沉淀分离方法 分离原理 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在酶液中添加一定浓度的中性 盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从而使酶与杂质分离
8 重点：酶提取过程中应注意的主要问题、各种酶的分离纯化方法。 难点：凝胶过滤法的原理、亲和层析的原理和大规模电泳的方法原理以及酶分离纯化的策略。 （三）教学方法、手段 多媒体课件辅以板书、提问 （四）教学内容： 第一节 细胞破碎 一、酶原材料的选择； 二、细胞破碎方法：机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶学破碎法。 分 类 细胞破碎方法 细胞破碎原理 机械破碎法 捣碎法 研磨法 匀浆法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 物理破碎法 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结 构破坏，而使细胞破碎。 化学破碎法 添加有机溶剂 添加表面活性剂 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 酶促破碎法 自溶法 外加酶制剂法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 第二节 酶的提取 一、酶提取的主要方法：酸抽提、碱抽提、盐抽提和有机溶剂抽提 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.02～0.5mol/L 的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取 PH2～6 的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 PH8～12 的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 二、酶提取过程中应注意的主要问题。 主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外，还受到温度、pH 值、提取液体积等提取条件的影响。 第三节 酶的分离纯化方法 一、沉淀分离 根据酶的溶解度设计的分离方法，包括盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合 物沉淀法； 沉淀分离方法 分离原理 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性 盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离
等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性,通 过调节溶液的p值,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的某种有机溶剂,使酶或杂质 沉淀析出,从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 在酶液中加入某些物质,使它与酶形成复合物而沉淀下来,从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,从而使酶与杂质分离 二离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时,要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同,选择适当的离心机、离心 方法和离心条件。 1.离心机的选择 离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类,可以分为常速(低速)离心机、高速离心机和超 速离心机3种。 2离心方法的选用 对于常速离心机和高速离心机,由于所分离的颗粒大小和密度相差较大,只要选择好离心速度和离心 时间,就能达到分离效果 如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒,需要采用差速离心方法。 而对于超速离心,则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。 三过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等 根据过滤介质的不同,过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4大类。它们的主要 特性如表4-4所示。 过滤的分类及其特性 类别 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 > 2um 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、 烧结金属等 微滤 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷 超滤 20A~0.2um 病毒、生物大分子等 超滤膜 反渗透 生物小分子、盐、离子 反渗透膜 非膜过滤 采用高分子膜以外的材料,如滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为 非膜过滤。包括粗滤和部分微滤 四、层析分高 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分 子亲和力、分配系数等)的不同,使各组分以不同比例分布在两相中。其中一个相是固定的称为固定
9 等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通 过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质 沉淀析出，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 二.离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心 方法和离心条件。 1.离心机的选择 离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、高速离心机和超 速离心机 3 种。 2 离心方法的选用 对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心 时间，就能达到分离效果； 如果希望从样品液中分离出 2 种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。 而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。 三.过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。 根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等 4 大类。它们的主要 特性如表 4-4 所示。 过滤的分类及其特性 类别 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 > 2μm 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、 固形物等 滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、 烧结金属等 微滤 0.2～2μm 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷 超滤 20Å～0.2μm 病毒、生物大分子等 超滤膜 反渗透 < 20Å 生物小分子、盐、离子 反渗透膜 非膜过滤 采用高分子膜以外的材料,如滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为 非膜过滤。包括粗滤和部分微滤。 四、层析分离 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分 子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。其中一个相是固定的称为固定
相,另一个相是流动的,称为流动相。当流动相流经固定相时,各组分以不同的速度移动,从而使不 同的组分分离纯化 分离纯化酶采用的层析方法常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等, 如表4-5所示。 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同,而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不同而达到分 离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达 到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起,实现组分分离 五、萃取分高 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术 萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。 按照两相的组成不同,萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。 1有机溶剂萃取 用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如,用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶: 用苯酚萃取RNA等 2双水相萃取:双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。 3超临界萃取:超临界萃取又称为超临界流体萃取,是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度 不同而达到分离的一种萃取技术 4反胶東萃取:反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 六、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳 电泳方法按其使用的支持体,可以分为: 纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳 几种重要的蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳,通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术 第四节结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程
10 相，另一个相是流动的，称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不 同的组分分离纯化。 分离纯化酶采用的层析方法常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等， 如表 4-5 所示。 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分 离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达 到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 五、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。 按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。 1 有机溶剂萃取 用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶； 用苯酚萃取 RNA 等。 2 双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。 3 超临界萃取 ： 超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度 不同而达到分离的一种萃取技术。 4 反胶束萃取：反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 六、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体，可以分为： 纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳 几种重要的蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 第四节 结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程
