第三节重组子的筛选与鉴定 遗传学检测法 物理检测法 核酸分子杂交检测法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析及其他方法
第三节 重组子的筛选与鉴定 一、 遗传学检测法 二、 物理检测法 三、 核酸分子杂交检测法 四、免疫化学检测法 五、 核酸序列分析及其他方法
第三节重组子的筛选与鉴定 相关概念 转化子 导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞; 重组子 含有重组DNA分子的转化子; 筛选和选择 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后,获得所需的阳性 重组子的过程 筛选 通过某种特定的方法,如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体 或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程 选择 通过某种外加因素的辨别作用,呈现具有重组DNA分子的特定克 隆的方法
第三节 重组子的筛选与鉴定 相关概念 转化子 导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子 含有重组DNA分子的转化子； 筛选和选择 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需的阳性 重组子的过程； 筛选 通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体 或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程； 选择 通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆的方法
遗传学检测法 该方法要求克隆基因能够表达,并利用相应的基因突变型作为受 体细胞,当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时,我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 优点:简便、快速,结果较可靠 缺点:基因必须表达并具有合适的受体细胞。 (一)根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1.抗药性标记插入失活选择法 2.β-半乳糖苷酶显色反应选择法 (二)根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因,能够对大肠杆菌寄主菌株所具 有的突变体发生体内抑制或互补效应,从而使被转化的寄主细胞表现 出外源基因编码的表型特征
一、遗传学检测法 该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受 体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 优点：简便、快速，结果较可靠。 缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具 有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现 出外源基因编码的表型特征
遗传学检测法 (-)载体表型选择法 1抗药性标记及其插入失活 选择法 如:pBR322质粒上有两 个抗菌素抗性基因:Ter和 amp BRs (363 bases) 7r上有插入位点 Bamh I和 Sali Amp上有插入位点PstI
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活 选择法 如：pBR322质粒上有两 个抗菌素抗性基因: Tetr和 Ampr 。 Tetr上有插入位点BamH I和 Sal I; Ampr上有插入位点Pst I
遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR32抗菌素标记选择 (1)四环素:抑制细菌生长,但不杀死细菌 (2)氨苄青霉素抗性基因:产生β-内酰胺酶,使 氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液 (I2 KI-Aampicillin)(蓝灰色)褪色 (3)环丝氨酸:杀死生长的细菌,但不杀死停 止生长的细菌
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使 氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停 止生长的细菌
遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322选择过程 (1)四环素抗性插入失活 如果在et上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失 活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 e失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死, 保留下来; Te不失活的菌抗四环素,能分裂生长,反而被环丝 氨酸杀死
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失 活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死， 保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝 氨酸杀死
遗传学检测法 四环素+环丝氨酸培养基 pBR322 氨苄青霉 素培养基 Cr 外源DA插入 四环素抗性基因 无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法 无环丝氨酸培养基
遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322选择过程 (2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Amp上插入外源DNA,导致氨苄 四环素培养基 pBR322 加入碘-青霉素 指示液 外源DNA插入氨苄 青霉素抗性基因 挑选兰色克隆
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示 液选择
遗传学检测法 )载体表型选择法 2_B-半乳糖苷酶显色反应选择法 乳糖 半乳糖 +葡萄糖 β-半乳糖苷酶 半乳糖+5溴4氯靛蓝 深蓝色 (1)原理 载体上有一段半乳糖苷酶基因(LacZ)的a片段(氨基 端),其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的β 半乳糖苷酶基因(a片段缺失),可以被PTG诱导表达。载体和 受体菌基因组可以互补形成完整有功能的β-半乳糖苷酶
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 X-gal 半乳糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色 + （1）原理 载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基 端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的- 半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）, 可以被IPTG诱导表达。 载体和 受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶
遗传学检测法 (一)载体表型选择法 2.β-半乳糖苷酶显色反应选择法 Lacz 含Amp、Xgal、 a Lacz a IPTG的培养基 六 的a片段中插入外源M选白色克隆 载体B半乳糖苷酶基因 假阳性: 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子 (不破坏α肽
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程 假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子； （不破坏肽）