发酵工程实验指导书二O一八
发酵工程实验指导书 二〇一八
目录基础实验实验一酵母菌的分离和纯化实验二乳酸菌的分离和鉴别4实验三发酵菌株的初筛8实验四土壤中产醋酸菌种的分离筛选11实验五枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育..13实验六枯草芽孢杆菌生长曲线的测定16实验七发酵培养基营养条件的优化18实验八发酵罐的构造及空消..20实验九淀粉的液化及糖化..25实验十.29总糖和还原糖的测定--DNS法实验十一固定化酵母酒精发酵32综合实验综合实验一糯米甜酒的制备35综合实验二酸乳的制作. 38综合实验三葡萄酒的酿造44综合实验四啤酒发酵50实验一协定法糖化试验. 51实验二.54啤酒酵母纯种分离.实验三啤酒酵母的计数56实验四啤酒酵母的质量检查58
目 录 基础实验 实验一 酵母菌的分离和纯化. 1 实验二 乳酸菌的分离和鉴别. 4 实验三 发酵菌株的初筛 . 8 实验四 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 . 11 实验五 枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育. 13 实验六 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定 . 16 实验七 发酵培养基营养条件的优化 . 18 实验八 发酵罐的构造及空消. 20 实验九 淀粉的液化及糖化. 25 实验十 总糖和还原糖的测定──DNS 法 . 29 实验十一 固定化酵母酒精发酵. 32 综合实验 综合实验一 糯米甜酒的制备. 35 综合实验二 酸乳的制作 . 38 综合实验三 葡萄酒的酿造. 44 综合实验四 啤酒发酵 . 50 实验一 协定法糖化试验 . 51 实验二 啤酒酵母纯种分离. 54 实验三 啤酒酵母的计数 . 56 实验四 啤酒酵母的质量检查. 58
实验五啤酒酵母的扩大培养61实验六62麦芽汁的制备实验七糖度的测定65实验八啤酒主发酵.69实验九总还原糖含量的测定（斐林试剂法）.71实验十【-氨基氮含量的测定73a实验十一酸度和pH的测定.75实验十二比重的测定.77实验十三.80酒精度的测定及原麦汁浓度的计算实验十四双乙酰含量的测定84实验十五色度的测定.86实验十六苦味质的测定.88实验十七.89二氧化碳含量的测定实验十八90后发酵91实验十九啤酒质量品评
实验五 啤酒酵母的扩大培养. 61 实验六 麦芽汁的制备 . 62 实验七 糖度的测定 . 65 实验八 啤酒主发酵 . 69 实验九 总还原糖含量的测定（斐林试剂法）. 71 实验十 α –氨基氮含量的测定. 73 实验十一 酸度和 pH 的测定. 75 实验十二 比重的测定 . 77 实验十三 酒精度的测定及原麦汁浓度的计算. 80 实验十四 双乙酰含量的测定. 84 实验十五 色度的测定 . 86 实验十六 苦味质的测定 . 88 实验十七 二氧化碳含量的测定. 89 实验十八 后发酵. 90 实验十九 啤酒质量品评 . 91
实验一酵母菌的分离和纯化实验目的一、应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。三、实验材料及试剂1.成熟葡萄或苹果等果皮。2．马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200g）、葡萄糖（20g）、琼脂（20g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。(2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。（3）在120℃条件下高压灭菌20分种。3.乳酸马铃薯葡萄糖培养液：原料：马铃薯（200g）、葡萄糖（20g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。4.0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。5.生理盐水四、主要仪器设备1
1 实验一 酵母菌的分离和纯化 一、 实验目的 应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯 化的基本方法。 二、 实验原理 大多数酵母菌为腐生，其生长最适 pH为 4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如 果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中， 酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体 培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。 三、 实验材料及试剂 1. 成熟葡萄或苹果等果皮。 2. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装 三角瓶。配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称 200 g 并加蒸馏水 1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤， 补足蒸馏水量至 1000ml，制成 20%的马铃薯汁。 （2）在 20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃 薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。 （3）在 120℃条件下高压灭菌 20 分种。 3. 乳酸马铃薯葡萄糖培养液： 原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水 （1000mL），分装三角瓶。 4. 0.1%美蓝染液：0.1g 美蓝溶于 100mL 蒸馏水中。 5. 生理盐水 四、 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1m1的无菌吸管、18*180mm试管、培养血、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。五、实验方法1.接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装100mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取1mL接入到9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置28～30℃，培养24小时。（每组转接3支试管）2．加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液1mL，注入另一管9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28～30℃再培养24h。3.镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的0.1%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，菌体不着色。4.涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取0.1mL加富培养液到平板中，涂匀后28～30℃培养24h。5.分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。6.镜检：挑取单菌落，制片观察形态。7.挑取单个纯菌落，每组转接3支斜面试管，备用。六、实验结果的观察及记录时间试管1试管2试管3观察并记录第一次接种后观察试管内培养液的情况+观察试管内培养液的情况镜检培养液内菌的形态结构2加富培养后粗略判断是否为酵母菌3分离纯化后观察培养皿内菌落形态七、实验注意事项2
2 高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml 的无菌吸管、 18*180mm 试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、 纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。 五、 实验方法 1. 接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装 100mL 无菌生理盐水的三角瓶中，充 分搅拌后，用无菌移液管吸取 1mL 接入到 9mL 乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置 28～30℃，培养 24 小时。（每组转接 3 支试管） 2. 加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液 1mL，注入另一管 9mL 乳酸马铃薯葡 萄糖培养液中，置 28～30℃再培养 24h。 3. 镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的 0.l%美蓝染色液中， 混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情 况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原， 菌体不着色。 4. 涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取 0.1mL 加富培 养液到平板中，涂匀后 28～30℃培养 24h。 5. 分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。 6. 镜检：挑取单菌落，制片观察形态。 7. 挑取单个纯菌落，每组转接 3 支斜面试管，备用。 六、 实验结果的观察及记录 时间 观察并记录 试管1 试管2 试管3 1 第一次接种后 观察试管内培养液的情况 2 加富培养后 观察试管内培养液的情况 镜检培养液内菌的形态结构 粗略判断是否为酵母菌 3 分离纯化后 观察培养皿内菌落形态 七、 实验注意事项
1.配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸，2.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。3.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。3
3 1. 配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸。 2. 灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开 人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能 开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。 3. 接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒
实验二乳酸菌的分离和鉴别实验目的一、了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。二、实验原理乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在BCG牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状：乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标的检测。三、实验材料及试剂1.实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。2.1BCG牛乳培养基：（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH6.8（用1mo1/LNa0H或1mo1/LHC）调pH），121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均匀后倒平板。3.生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。4.脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与5%熊糖水按照1：10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，121℃灭菌15min。5.革兰氏染色液、香柏油、二甲苯6.0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液7.1%酚酞指示剂：1g酚溶于95%酒精，定容至100mL四、仪器设备4
4 实验二 乳酸菌的分离和鉴别 一、 实验目的 了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。 二、 实验原理 乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分 成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在 BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳 酸菌菌落大约 1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸 菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长 丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。 含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液 接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌 落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标 的检测。 三、 实验材料及试剂 1. 实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。 2. BCG 牛乳培养基： （A）溶液：脱脂乳粉 100g，水 500mL，加入 1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液 1mL，80℃ 灭菌 20min。 （B）溶液：酵母膏 10g，水 500mL，琼脂 20g，pH 6.8（用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 调 pH），121℃湿热灭菌 20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平 板。 3. 生理盐水：称取 9g 氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000 毫升。 4. 脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与 5%蔗糖水按照 1:10 的比例配制，装 量以试管的 1/3 为宜，121℃灭菌 15min。 5. 革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 6. 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液 7. 1%酚酞指示剂 ：1g 酚酞溶于 95%酒精，定容至 100mL 四、 仪器设备
超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜、显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、1mL和10mL移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、涂布器、载玻片、涂布棒、250mL三角瓶、滤纸条等。五、实验方法与步骤（一）乳酸菌的分离1．菌悬液的配制：取一洁净三角瓶，盛以225mL生理盐水；6支洁净试管，各盛9mL的生理盐水；加塞包扎于121℃高压蒸汽灭菌20min，得到无菌生理盐水。2.将酸奶样品搅拌均匀，用10mL无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，充分振摇，使样品均匀分散，即为1：10的均匀稀释液；3．将6支装9mL生理盐水的无菌试管，依次标记10°、10、10、10、10°、10°，取1mL无菌移液管吸1:10的菌悬液沿管壁徐徐注入装有9mL灭菌生理盐水的试管中，稀释混匀便得到1：100稀释液，按上述操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。根据样品情况，制得10～10的稀释液。4.倒平板：取无菌平皿9个，编号标明10″、10°、10各三套；按无菌操作将经高温消毒冷却到50℃左右的培养基注入9个平血，每皿约15mL；转动平皿，使培养基均匀分布在皿底，待凝固。5.检样的吸取：用三支1mL无菌移液管分别吸取10、10和10的稀释菌悬液各0.1mL，对号接入与之对应的3个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20min；待样液吸收后倒置平皿于40℃恒温箱中培养48h。6.菌落观察：取出已培养48h培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。7.镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌：其中乳酸杆菌皇杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状，（二）乳酸菌的鉴别1.选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8～24h。5
5 超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜、显微镜、碱 式滴定仪、天平、培养皿、1mL 和 10mL 移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接 种针、涂布器、载玻片、涂布棒、250mL 三角瓶、滤纸条等。 五、 实验方法与步骤 （一）乳酸菌的分离 1. 菌悬液的配制：取一洁净三角瓶，盛以 225mL 生理盐水；6 支洁净试管，各盛 9mL 的 生理盐水；加塞包扎于 121℃高压蒸汽灭菌 20min，得到无菌生理盐水。 2. 将酸奶样品搅拌均匀，用 10mL 无菌移液管吸取样品 25ml 加入盛有 225ml 无菌生理盐 水的三角瓶中，充分振摇，使样品均匀分散，即为 1:10 的均匀稀释液； 3. 将 6 支装 9mL 生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取 1mL 无菌移液管吸 1:10 的菌悬液沿管壁徐徐注入装有 9mL 灭菌生理盐水的试管中，稀 释混匀便得到 1:100 稀释液，按上述操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释 一次即换用 1 支 1mL 吸管。根据样品情况，制得 10-3～10-7 的稀释液。 4. 倒平板：取无菌平皿 9 个，编号标明 10-5、10-6、10-7 各三套；按无菌操作将经高温消 毒冷却到 50℃左右的培养基注入 9 个平皿，每皿约 15mL；转动平皿，使培养基均匀分 布在皿底，待凝固。 5. 检样的吸取：用三支 1 mL 无菌移液管分别吸取 10-5、10-6 和 10-7 的稀释菌悬液各 0.1 mL，对号接入与之对应的 3 个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布 均匀，平放于试验台上 20min；待样液吸收后倒置平皿于 40℃恒温箱中培养 48 h。 6. 菌落观察：取出已培养 48 h 培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进 行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约 1-3mm，圆形隆起， 表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。 7. 镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂 片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中乳酸杆菌呈杆 状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。 （二）乳酸菌的鉴别 1. 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养 8～24h
2.观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色，显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。（1）观察并记录各试管的凝乳时间（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度滴定酸度：吸取10ml牛乳，置于250ml三角瓶中，加入20ml水，再加入0.5m10.5%的酚乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在1min内不消失为止。消耗0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度。注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳10ml，置于250ml三角烧瓶中，加人20ml蒸馏水，再加入3滴0.005%碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定的标准颜色。其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少0.005%碱性品红滴数即可。（3）计数：采用注平板法，测定菌落数量实验结果六、1.菌种培养观察并记录结果时间10-510-610-7观察并记录菌落观察48h镜检形态2.脱脂乳发酵观察与测定时间/h凝乳状态酸度测定活菌计数24七、革兰氏染色注意事项1．涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察细菌的形态。6
6 2. 观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色， 显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。 （1）观察并记录各试管的凝乳时间 （2）酸度测定：用 NaOH 滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度 滴定酸度：吸取 10ml 牛乳，置于 250ml 三角瓶中，加入 20ml 水，再加入 0.5m1 0.5% 的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在 1 min 内不消失为止。消耗 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以 10，即得酸度。 注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。 取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳 10ml，置于 250 ml 三角烧瓶中，加 人 20ml 蒸馏水，再加入 3 滴 0.005%碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定 的标准颜色。 其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀 释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少 0.005%碱性品红滴数即可。 （3）计数：采用倾注平板法，测定菌落数量 六、 实验结果 1. 菌种培养观察并记录结果 时间 观察并记录 10-5 10-6 10-7 48h 菌落观察 镜检形态 2. 脱脂乳发酵观察与测定 时间/h 凝乳状态 酸度测定 活菌计数 24 七、 革兰氏染色注意事项 1. 涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察细 菌的形态
2.染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。3.染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态7
7 2. 染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。 3. 染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱 色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙 醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态