《生物技术制药》课程实验指导书（共六篇）

生物技术制药实验2018

生物技术制药实验 2018

目录第一篇基因工程制药综合实验实验一SIX1基因的PCR扩增反应实验二水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA11实验三DNA的重组连接14实验四重组质粒的转化18实验五转化子DNA的快速提取22实验六重组转化子的PCR鉴定24第二篇细胞工程制药综合实验26实验一细胞培养26实验二PEI转染动物细胞28实验三动物细胞蛋白的提取方法.31实验四蛋白浓度测定方法32实验五SDS-PAGE电泳33实验六WESTERNBLOT检测35第三篇酶工程制药综合实验41高产淀粉酶菌株的筛选41V

V 目 录 第一篇 基因工程制药综合实验. 7 实验一 基因的 PCR 扩增反应. 8 实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA. 11 实验三 DNA 的重组连接. 14 实验四 重组质粒的转化 . 18 实验五 转化子 DNA 的快速提取. 22 实验六 重组转化子的 PCR 鉴定. 24 第二篇 细胞工程制药综合实验. 26 实验一 细胞培养. 26 实验二 PEI 转染动物细胞 . 28 实验三 动物细胞蛋白的提取方法 . 31 实验四 蛋白浓度测定方法. 32 实验五 SDS-PAGE 电泳. 33 实验六 WESTERN BLOT 检测 . 35 第三篇 酶工程制药综合实验. 41 高产淀粉酶菌株的筛选 . 41

第四篇沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定45第五篇免疫组织化学检测48第六篇发酵罐说明及使用.51实验一气升式生化反应器的应用51实验二中试发酵设备的使用方法53附录发酵罐的简介....56VI

VI 第四篇 沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定. 45 第五篇 免疫组织化学检测. 48 第六篇 发酵罐说明及使用. 51 实验一 气升式生化反应器的应用 . 51 实验二 中试发酵设备的使用方法 . 53 附录 发酵罐的简介. 56

第一篇基因工程制药综合实验SIX1重组质粒的构建及蛋白表达质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数的线性质粒；天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copynumber）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。近几十年来，由于分子生物学的发展，人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源DNA（特异片段或全长片段）插入到载体质粒中形成重组DNA，然后将该重组DNA转运到宿主细胞中。常规的质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同的粘性未端。当前还有In-Fusion融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的16～18hr缩短到15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。Six1作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现，SIX1过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表现出Six1过表达。同时SIX1和EYA结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向SIX1或SIX1-EYA将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达Six1蛋白基因工程菌为目的，通过PCR技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用Westernblot法检测SIXl目的蛋白，以此确定SIX1目的蛋白被正确表达，本实验以DH5α大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化BL21，构建含有BL21-pET28a-SIX1基因工程菌，经过菌落PCR等方法进行验证。7

7 第一篇 基因工程制药综合实验 SIX1 重组质粒的构建及蛋白表达 质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区 DNA 原有的能够自主复制的 较小的 DNA 分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中， 乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以 同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数 的线性质粒；天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中 就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能 力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有 决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 近几十年来,由于分子生物学的发展,人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种 成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。 质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源 DNA（特异片段或全 长片段）插入到载体质粒中形成重组 DNA，然后将该重组 DNA 转运到宿主细胞中。常规的 质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同 的粘性末端。当前还有 In-Fusion 融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的 16～18hr 缩短到 15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。 Six1 作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现， SIX1 过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表 现出 Six1 过表达。同时 SIX1 和 EYA 结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向 SIX1 或 SIX1-EYA 将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达 Six1 蛋白基因工程菌 为目的，通过 PCR 技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用 Western blot 法检测 SIX1 目的蛋白，以此确定 SIX1 目的蛋白被正确表达， 本实验以 DH5α 大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化 BL21，构建含 有 BL21-pET28a-SIX1 基因工程菌，经过菌落 PCR 等方法进行验证

实验一SIX1基因的PCR扩增反应一、实验目的1.学习PCR反应的基本原理与实验技术。2.了解引物设计的一般要求。二、实验原理单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA多聚酶按5'→3方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。扩增后的双链DNA分子经高温变性后文成为两条单链DNA，它们都可作为模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出各自互补的产物DNA。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5端的引物(P1)对应于上链DNA单链的序列，3°端的引物（P2)对应于下链DNA单链的序列，P1和P2按5'→3方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，然后在一中间温度作用下，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2"方式扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量足够，扩增过程无限重复，便可使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此用微量的DNA样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆。目前，PCR技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃。复性温度为37C～55℃（具体反应温度应根据引物的Tm值而决定），合成延伸温度为72℃，DNA聚台酶为Tag酶（可耐受95℃左右的高温而不失活)，DNA扩增倍数为1010%。引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25个核苷酸；②CG含量为40%～60%；③TM值高于55℃[TM=4(C十G)十2(A十T)计算]：④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；③两条引物间配对碱基数小于5个；③避免引物内部形成二级结构，若引物自身配对（特别是在引物的3端形成茎环结构），茎的碱基对数不大于3。8

8 实验一 SIX1 基因的 PCR 扩增反应 一、实验目的 1．学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 2．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 单链 DNA 在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用 DNA 多聚酶按 5’→3’方向复制出 互补 DNA。这时单链 DNA 称为模板 DNA，寡聚核苷酸片段称为引物(Primer)，合成的互补 DNA 称为产物 DNA。扩增后的双链 DNA 分子经高温变性后又成为两条单链 DNA，它们都 可作为模板 DNA，在相应的引物引导下，用 DNA 聚合酶复制出各自互补的产物 DNA。PCR 反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列 DNA 分子两端各设计一条引物，其中 在 DNA 5’端的引物(P1)对应于上链 DNA 单链的序列，3’端的引物(P2)对应于下链 DNA 单链 的序列，P1 和 P2 按 5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA 合成底物 dNTPs (dATP、dCTP、 dGTP、dTTP4 种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中，通过高温变性，使双链 DNA 变成单链 DNA 模板，降低温度复性，使引物与模板 DNA 配对，然后在一中间温度作用下， 利用 DNA 聚合酶便可合成产物 DNA。引物和 dNTPs 过量，则在同一反应体系中可重复高温 变性、低温复性和 DNA 合成这—循环，使产物 DNA 重复合成，并且在重复过程中，前一循 环的产物 DNA 可作为后一循环的模板 DNA 参与 DNA 的合成，使产物 DNA 的量按 2 n方式 扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及 dNTP 的量足够，扩增过程无限 重复，便可使模板 DNA 无限扩增。PCR 反应使几个 DNA 模板分子通过数小时扩增后增加到 百万倍以上，因此用微量的 DNA 样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克 隆。目前，PCR 技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究 和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。 常规 PCR 反应用于已知 DNA 序列的扩增，反应循环数为 25～35，变性温度为 94℃。复 性温度为 37C～55℃（具体反应温度应根据引物的 Tm 值而决定），合成延伸温度为 72℃， DNA 聚台酶为 Taq 酶(可耐受 95℃左右的高温而不失活)，DNA 扩增倍数为 106～109。 引物的设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25 个核苷酸；②CG 含量 为 40％～60％；③TM 值高于 55℃ [TM＝4(C 十 G)十 2(A 十 T)计算]；④引物与模板非特异 性配对位点的碱基配对率小于 70％；⑤两条引物间配对碱基数小于 5 个；⑥避免引物内部形 成二级结构，若引物自身配对(特别是在引物的 3’端形成茎环结构)，茎的碱基对数不大于 3

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计，现开发出的计算机软件还不太多，我们通常都用primer5软件以及NCBI网站上设计、修改引物。三、材料和仪器PCR仪，台式离心机，移液器（0.1-2.5uL），200uLPCR管，吸头，离心管，手套，制冰机，微量移液器（10、100μL量程各一支）。PCRmix（内含Taq酶，dNTP，缓冲液等），10×buffer(PCR缓冲液）上游引物，下游引物；模板DNA（Mr203850质粒购自OriGene）；ddHO。*SIX1的cDNA序列（249-1103，854bp）：Atgtcgatgc gccgtcgtttggctttacgcaggagcaagtggcgtgcgtgtgcgaggttctgcagcaaggcggaaacctGgagcgcct gggcaggttcctgtggtcactgcccgcctgcgaccacctgcacaagaacgagagcgtactcaaggccaaggcggtggtcgccttccaccgcggcaacttccgtgagctctacaagatcctggagagccaccagttctcgcctcacaaccaccccaaactgcagcaactgtggctgaaggcgcattacgtggaggccgagaagctgcgcggccgacccctgggcgccgtgggcaaatatcgggtgcgccgaaaattccactgccgcgcaccatctgggacggcgaggagaccagctactgcttcaaggagaagtcgaggggtgtcctgcgggagtggtacgcgcacaatccctacccatcgccgcgtgagaagcgggagctggccgaggccaccggcctcaccaccacccaggtcagcaactggtttaagaaccggaggcaaagagaccgggccgcggaggccaaggaaagggagaacaccgaaaacaataactcctcctccaacaagcagaaccaactctctcctctggaagggggcaagccgctcatgtccagctcagaagaggaattctcacctccccaaagtccagaccagaactcggtccttctgctgcagggcaatatgggccacgccaggagctcaaactattctctcccgggcttaacagcctcgcagcccagtcacggcctgcagacccaccagcatcagctccaagactctctgctcggccccctcacctccagtctggtggacttggggtcctaa多肽序列：1msmlpsfgft qeqvacvcev lqqggnlerl grflwslpac dhlhknesvl kakavvafhr61 gnfrelykil eshqfsphnh pklqqlwlkahyveaeklrg rplgavgkyr vrrkfplprt121 iwdgeetsyc fkeksrgvlr ewyahnpyps prekrelaea tgltttqvsn wfknrrqrdr181 aaeakerent ennnsssnkq nqlspleggk plmssseeef sppqspdqns vlllqgnmgh241 arssnyslpg Itasqpshglqthqhqlqds llgpltsslvdlgs试根据上述序列及设计原则为本实验设计引物序列：上游引物：下游引物：四、实验操作1.准备PCR反应溶液

9 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计，现开发出的计算机软 件还不太多，我们通常都用 primer5 软件以及 NCBI 网站上设计、修改引物。 三、材料和仪器 PCR 仪，台式离心机，移液器（0.1-2.5 μL），200 μL PCR 管，吸头，离心管，手套，制 冰机，微量移液器（10、100 μL 量程各一支）。 PCRmix（内含 Taq 酶，dNTP，缓冲液等），. 10×buffer (PCR 缓冲液) 上游引物，下游引物；模板 DNA（Mr203850 质粒购自 OriGene）； ddH2O。 *SIX1 的 cDNA 序列（249-1103，854bp）： Atgtcgatgc gccgtcgtttggctttacgcaggagcaagtggcgtgcgtgtgcgaggttctgcagcaaggcggaaacct Ggagcgcct gggcaggttcctgtggtcactgcccgcctgcgaccacctgcacaagaacgagagcgtactcaaggccaagg cggtggtcgccttccaccgcggcaacttccgtgagctctacaagatcctggagagccaccagttctcgcctcacaaccac cccaaactgcagcaactgtggctgaaggcgcattacgtggaggccgagaagctgcgcggccgacccctgggcgccgtggg caaatatcgggtgcgccgaaaatttccactgccgcgcaccatctgggacggcgaggagaccagctactgcttcaaggaga agtcgaggggtgtcctgcgggagtggtacgcgcacaatccctacccatcgccgcgtgagaagcgggagctggccgaggcc accggcctcaccaccacccaggtcagcaactggtttaagaaccggaggcaaagagaccgggccgcggaggccaaggaaag ggagaacaccgaaaacaataactcctcctccaacaagcagaaccaactctctcctctggaagggggcaagccgctcatgt ccagctcagaagaggaattctcacctccccaaagtccagaccagaactcggtccttctgctgcagggcaatatgggccac gccaggagctcaaactattctctcccgggcttaacagcctcgcagcccagtcacggcctgcagacccaccagcatcagct ccaagactctctgctcggccccctcacctccagtctggtggacttggggtcctaa 多肽序列： 1 msmlpsfgft qeqvacvcev lqqggnlerl grflwslpac dhlhknesvl kakavvafhr 61 gnfrelykil eshqfsphnh pklqqlwlka hyveaeklrg rplgavgkyr vrrkfplprt 121 iwdgeetsyc fkeksrgvlr ewyahnpyps prekrelaea tgltttqvsn wfknrrqrdr 181 aaeakerent ennnsssnkq nqlspleggk plmssseeef sppqspdqns vlllqgnmgh 241 arssnyslpg ltasqpshgl qthqhqlqds llgpltsslv dlgs 试根据上述序列及设计原则为本实验设计引物序列： 上游引物： 下游引物： 四、实验操作 1. 准备 PCR 反应溶液

PCR反应体系（25uL）10×PCR缓冲液2.5μL2mmol/LdNTPs2.5μL25mmol/LMgCl22.5μL12.5pmol/L上游引物1.0μL12.5pmol/L下游引物1.0μL1.0μL100-200ng/L模板DNA0.5UTaqDNA聚合酶ddH,O加至25μL在冰上配制PCR反应物溶液。振荡混匀，短时离心。2.PCR扩增反应按以下步骤分别在PCR仪中进行30个循环的PCR扩增反应：95℃预变性5min95℃变性30s63.8℃退火30s30个循环72℃延伸45s72℃延伸10min4℃保存3.结果检测用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。五、注意事项：1、加样时要精确用移液器；2、检查PCR仪是否热盖；3、试剂冰浴融化后要离心；4、分装后需离心均匀。六、思考题1.PCR效率的高低取决于什么？2.为什么要稀释引物？3.PCR反应必须热盖吗？为什么？10

10 PCR 反应体系（25 uL） 10×PCR 缓冲液 2.5L 2mmol/L dNTPs 2.5L 25 mmol/L MgCl2 2.5L 12.5pmol/L 上游引物 1.0L 12.5pmol/L 下游引物 100-200ng/L 模板 DNA 1.0L 1.0L Taq DNA 聚合酶 0.5U ddH2O 加至 25L 在冰上配制 PCR 反应物溶液。振荡混匀，短时离心。 2. PCR 扩增反应 按以下步骤分别在 PCR 仪中进行 30 个循环的 PCR 扩增反应： 95℃ 预变性 5min 95℃ 变性 30s 63.8℃ 退火 30s 30 个循环 72℃ 延伸 45s 72℃ 延伸 10min 4℃ 保存 3. 结果检测 用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。 五、注意事项： 1、加样时要精确用移液器； 2、检查 PCR 仪是否热盖； 3、试剂冰浴融化后要离心； 4、分装后需离心均匀。 六、思考题 1. PCR 效率的高低取决于什么？ 2. 为什么要稀释引物？ 3. PCR 反应必须热盖吗？为什么？

实验二水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA一、实验目的学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小二、实验原理这是基因工程操作中最常规的实验方法，它简便易行，只需少量的DNA就能检测。电泳后的凝胶结果，通过漠化乙啶染色，然后与已知分子大小和含量的DNAMarker比较，则不仅可比较准确的估算出样品DNA的含量，还可估算出其分子量的大小，在提取的DNA样品不太纯的情况下，该法甚至比分光光度比色法还要准确。其原理是漠化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使DNA发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要5～10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1uμg的DNA。现在用核酸染料代替EB，污染减少。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的限制性内切酶酶切处理后，再与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果二条链发生断裂，就转变为线状(L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。11

11 实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 一、实验目的 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA 的纯度，DNA 的构型，含量以及分子量的大小。 二、实验原理 这是基因工程操作中最常规的实验方法，它简便易行，只需少量的 DNA 就能检测。电 泳后的凝胶结果，通过溴化乙啶染色，然后与已知分子大小和含量的 DNA Marker 比较，则 不仅可比较准确的估算出样品 DNA 的含量，还可估算出其分子量的大小，在提取的 DNA 样 品不太纯的情况下，该法甚至比分光光度比色法还要准确。其原理是溴化乙锭在紫外光照射 下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的 EB 就插入 DNA 分子 中形成荧光络合物；使 DNA 发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于 DNA 的含量，如 将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂 糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要 5～10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉 眼观察，可检测到 0.0l～0.1 µg 的 DNA。现在用核酸染料代替 EB，污染减少。 在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒 DNA 样品用 单一切点的限制性内切酶酶切处理后，再与已知分子量大小的标准 DNA 片段进行电泳对照， 观察其迁移距离，就可获知该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的 DNA， 也可以鉴别分子量相同，但构型不同的 DNA 分子。在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种因素 的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子， 如果二条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情 况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。 提取到的质粒 DNA 样品中还有染色体 DNA 或 RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观 察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷量 的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定 DNA 分子大小时，应当尽量减少电荷效应。 增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞 程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强 而提高分辨率

三、实验材料与仪器水平电泳槽，微波炉，天平，移液器，100mL或250mL锥形瓶，量筒，吸头，PE手套，BIO-RAD凝胶成像系统。1.cDNA产物，琼脂糖，荧光染料2.10xTAE缓冲液：24.2gTris碱，5.71mL冰乙酸，10ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容至5000mL，高压灭菌，用时可稀释为10倍用。3.漠酚蓝电泳加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。4.DNA标准marker五、实验步骤（一）制胶1.按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量及分离线状DNA分子的有限范围0.3%60~5(Kb)0.6%20~1 (Kb)0.7%10~0.8(Kb)0.9%7~0.5(Kb)1.2%6~0.4 (Kb)1.5%4~0.2(Kb)2.0%3~0.1 (Kb)例：称取0.2g琼脂糖，放入三角瓶中，加入20mL1×TAE缓冲液（大电泳槽约160mL小电泳槽约35mL凝胶液，等比扩容即可），置微波炉中加热至完全熔化3次，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。2.取有机玻璃内槽，洗净，晾干，形成一个模具。3.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在固定位置，使点样梳底部离电泳胶内槽水平面的距离为0.5~1.0mm。4.待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入荧光染料，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。5.室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30～45min）。同时选择合适的水平式的电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。6.将铺有凝固凝胶的有机玻璃内槽放置在水平电泳仪中，确保点样孔在仅负极一侧。加入0.5xTAE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。垂直轻拨梳子，保证点样12

12 三、实验材料与仪器 水平电泳槽，微波炉，天平，移液器，100 mL 或 250 mL 锥形瓶，量筒，吸头，PE 手套， BIO-RAD 凝胶成像系统。 1. cDNA 产物， 琼脂糖，荧光染料 2. l0×TAE 缓冲液：24.2g Tris 碱，5.71mL 冰乙酸，l0ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，定容至 5000mL，高压灭菌，用时可稀释为 10 倍用。 3．溴酚蓝电泳加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。 4．DNA 标准 marker 五、实验步骤 （一）制胶 1.按照被分离 DNA 分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下，可参考 下表： 琼脂糖的含量及分离线状 DNA 分子的有限范围 0.3% 60~5（Kb） 0.6% 20~1（Kb） 0.7% 10~0.8（Kb） 0.9% 7~0.5（Kb） 1.2% 6~0.4（Kb） 1.5% 4~0.2（Kb） 2.0% 3~0.1（Kb） 例：称取 0.2 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 20 mL 1× TAE 缓冲液（大电泳槽约 160mL 小电泳槽约 35mL 凝胶液，等比扩容即可），置微波炉中加热至完全熔化 3 次，取出摇匀，则 为 1％琼脂糖凝胶液。 2. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，形成一个模具。 3. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在固定位置， 使点样梳底部离电泳胶内槽水平面的距离为 0.5～1.0mm。 4. 待琼脂糖凝胶液冷却到 60℃ 左右时，加入荧光染料，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽， 直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 5. 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30～45 min）。同时选择合适的水平式的电泳 仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 6. 将铺有凝固凝胶的有机玻璃内槽放置在水平电泳仪中，确保点样孔在仅负极一侧。加 入 0.5×TAE 电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1 mm。垂直轻拔梳子，保证点样

孔完好；如点样孔中有气泡，可用吸管吸去。(二）加样在点样板或PE手套上混合15μLDNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释数应不小于1×。待测的DNA和Marker样品中，加1/5体积的漠酚蓝指示剂。混匀后小心地用10uL微量移液器进行点样，每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面，注意记录样品点样秩序与点样量。(三）电泳1.接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm（大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V）。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。3.254nm紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。注意事项：1.电泳槽正负极。2.注意电压。3.注意琼脂糖的比例。4.点样时注意不要戳破凝胶。5.制作凝胶时务必加核酸染料，且在40～50℃时加最适宜。六、思考题1.PCR电泳图出现拖尾、扫尾、空白处背景高是什么原因？解释一下这种现象。2.PCR电泳图出现几条条带？分别有什么意义？3.核酸染料是什么物质？作用原理？loadingbuffer的作用是什么？13

13 孔完好；如点样孔中有气泡，可用吸管吸去。 (二) 加样 在点样板或 PE 手套上混合 15 μL DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释数应 不小于 1×。待测的 DNA 和 Marker 样品中，加 1/5 体积的溴酚蓝指示剂。混匀后小心地用 10μL 微量移液器进行点样，每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。加样时勿碰坏样品孔 周围的凝胶面，注意记录样品点样秩序与点样量。 (三) 电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm（大电泳槽不超过 200V，小电泳槽不超过 150V）。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 3. 254nm 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。 注意事项： 1. 电泳槽正负极。 2. 注意电压。 3. 注意琼脂糖的比例。 4. 点样时注意不要戳破凝胶。 5. 制作凝胶时务必加核酸染料，且在 40～50℃时加最适宜。 六、思考题 1. PCR 电泳图出现拖尾、扫尾、空白处背景高是什么原因？解释一下这种现象。 2. PCR 电泳图出现几条条带？分别有什么意义？ 3. 核酸染料是什么物质？作用原理？loading buffer 的作用是什么？