一、菌种的衰退与复壮的概念 1.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏 过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有 优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象， 称为菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变，②分离现象。 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 第四节 菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮的概念 1.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏 过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有 优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象， 称为菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变，②分离现象。 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 第四节 菌种的衰退、复壮及保藏
2、 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种 恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况 下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找 出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义 的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行 纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提 高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种 菌种的复壮措施： ①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较 差的已衰退个体）。 ④采用有效的菌种保藏方法
2、 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种 恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况 下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找 出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义 的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行 纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提 高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种 菌种的复壮措施： ①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较 差的已衰退个体）。 ④采用有效的菌种保藏方法
3、防止菌种衰退的方法： ①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配 率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法， 可以减少移种和传代的数）； ②选择合适的培养条件； ③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生 物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； ④采用有效的菌种保藏方法
3、防止菌种衰退的方法： ①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配 率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法， 可以减少移种和传代的数）； ②选择合适的培养条件； ③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生 物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； ④采用有效的菌种保藏方法
二、菌种保藏： 1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种 2. 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生 孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生 长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境 要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）
二、菌种保藏： 1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种 2. 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生 孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生 长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境 要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）
菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上 3.菌种保藏的方法
菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上 3.菌种保藏的方法
3、方法： ①低温保藏法 方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 ②石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 ③干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保 藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌 保藏，保藏时间几至几十年
3、方法： ①低温保藏法 方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 ②石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 ③干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保 藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌 保藏，保藏时间几至几十年
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法
❖菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以 及便于研究、交换和使用的目的。 ❖菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 国内外菌种保藏机构：
❖菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以 及便于研究、交换和使用的目的。 ❖菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 国内外菌种保藏机构：
干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法） 冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 合适的载体 有机基质（曲料、麦粒） 滤纸片 薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成） 血清蛋白小片（.乙烯薄膜. ）
干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法） 冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 合适的载体 有机基质（曲料、麦粒） 滤纸片 薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成） 血清蛋白小片（.乙烯薄膜. ）
几种常用菌种保藏方法的比较 方法名称 主要措施 适宜菌种 保藏期 评 价 冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法 低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养 干燥、无氧、低 温、有保护剂 各大类 细菌、酵母菌 各大类** 产孢子微生物 各大类 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年 以上 简便 简便 简便 简便 有效 简便 有效
几种常用菌种保藏方法的比较 方法名称 主要措施 适宜菌种 保藏期 评 价 冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法 低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养 干燥、无氧、低 温、有保护剂 各大类 细菌、酵母菌 各大类** 产孢子微生物 各大类 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年 以上 简便 简便 简便 简便 有效 简便 有效