实验十 水中大肠菌群的 测定（综合性实验）
实验十 水中大肠菌群的 测定（综合性实验）
目的要求 ■1.学习测定水中大肠菌群数量的多管发 酵法。 ■ 2.了解大肠菌群的检测作为饮水卫生指 标的重要性
一、目的要求 ◼ 1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发 酵法。 ◼ 2．了解大肠菌群的检测作为饮水卫生指 标的重要性
基本原理 多管发酵法包括初（步)发酵试验、平板分离和 复发酵试验三个部分。 1.初（步）发酵试验 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置 一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多 细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产 酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内 加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养 基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制 其他细菌如芽胞菌生长的作用
二、基本原理 多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和 复发酵试验三个部分。 ◼ 1．初（步）发酵试验 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置 一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多 细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产 酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内 加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养 基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制 其他细菌如芽胞菌生长的作用
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时 内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色 改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但 也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气； 此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。 在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气， 此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需 继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌 群。48小时后仍不产气的为阴性结果
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时 内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色 改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但 也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气； 此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。 在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气， 此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需 继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌 群。48小时后仍不产气的为阴性结果
2.平板分离 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂 (远藤氏培养基，Endo's medium)或伊 红美蓝琼脂(eosin methylene blueagar, EMB agar),前者含有碱性复红染料，在此 作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色 使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产 生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合 物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。 亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长
◼ 2．平板分离 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂 （远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊 红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar， EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此 作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色， 使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产 生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合 物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。 亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长
伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦 作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时 该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与 远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽 的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小 时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平 板上划线分离菌落。 3.复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏 阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。 原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产 气的，最后确定为大肠菌群阳性结果
伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦 作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时， 该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与 远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽 的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小 时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平 板上划线分离菌落。 ◼ 3．复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏 阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。 原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产 气的，最后确定为大肠菌群阳性结果
三、器材 ■1、培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小 套管)，三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶） (内有倒置小套管)，伊红美蓝琼脂平板 1 灭菌水； ·2、仪器或其他用具载玻片，灭菌带玻璃塞 空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等
三、器材 ◼ 1、培养基 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小 套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶） （内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板， 灭菌水； ◼ 2、仪器或其他用具 载玻片，灭菌带玻璃塞 空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等
四、操作步骤 ■1.水样的采取 1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌 再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接 取水样，以待分析。 2)池水、河水或湖水应取距水面10~15cm的 深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸 入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入 瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最 好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却
四、操作步骤 ◼ 1．水样的采取 1)自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌， 再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接 取水样，以待分析。 2）池水、河水或湖水 应取距水面10～15cm的 深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸 入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入 瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最 好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却
2.自来水检查 (1)初（步)发酵试验在2个含有50ml三 倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入 100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖 蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图 XV-1)。混匀后，37℃培养24小时，24小 时未产气的继续培养至48小时。 (2)平板分离经24小时培养后，将产酸产 气及48小时产酸产气的发酵管（瓶)，分别 划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃ 下培养18~24小时，将符合下列特征的菌落 的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检
◼ 2．自来水检查 （1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三 倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入 100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖 蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图 ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小 时未产气的继续培养至48小时。 （2）平板分离经24小时培养后，将产酸产 气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别 划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃ 下培养 18～24小时，将符合下列特征的菌落 的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检
(a)深紫黑色、有金属光泽。 (b)紫黑色、不带或略带金属光泽。 (c)淡紫红色、中心颜色较深。 (3)复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰 氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分， 重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每 管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1~3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实 有大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的 阳性管（瓶）数查表XIV-2,即得大肠菌群数
（a）深紫黑色、有金属光泽。 （b）紫黑色、不带或略带金属光泽。 （c）淡紫红色、中心颜色较深。 （3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰 氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分， 重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每 管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实 有大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的 阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数