实验一细菌形态观察和染色实验
实验一 细菌形态观察和染色实验
一、目的要求 学习微生物涂片、染色基本技术和无菌操 作技术： 初步掌握革兰氏染色法； 巩固显微镜（油镜）的使用方法： 初步认识细菌的形态特征
一、目的要求 ❖ 学习微生物涂片、染色基本技术和无菌操 作技术; ❖ 初步掌握革兰氏染色法; ❖ 巩固显微镜（油镜）的使用方法; ❖ 初步认识细菌的形态特征
二、基本原理 革兰 碘 乙 最 结晶紫初染 液媒染 醇脱色 红复染 终结果 原理 蓝紫色 蓝紫 蓝 蓝 细胞壁肽聚糖层呈网状，壁厚、类 紫色 脂含量低，乙醇脱色时细胞壁脱水、 色 色 网状结构孔径缩小，透性降低，结 晶紫一碘的复合物仍保留在细胞内 蓝紫色 细胞壁肽聚糖层薄、类脂含量高， 色 色 色 乙醇脱色时类脂质被乙醇溶解，细 性菌 色 胞壁透性增大，结晶紫一碘的复合 (G) 物较易洗脱出来
二、基本原理 革兰 氏染 色程 序 结 晶 紫 初 染 碘 液 媒 染 乙 醇 脱 色 番 红 复 染 最 终 结 果 原理 革兰 氏阳 性菌 (G+ ) 蓝 紫 色 蓝 紫 色 蓝 紫 色 蓝 紫 色 蓝 紫 色 细胞壁肽聚糖层呈网状，壁厚、类 脂含量低，乙醇脱色时细胞壁脱水、 网状结构孔径缩小，透性降低，结 晶紫—碘的复合物仍保留在细胞内 革兰 氏阴 性菌 (G- ) 蓝 紫 色 蓝 紫 色 无 色 红 色 红 色 细胞壁肽聚糖层薄、类脂含量高， 乙醇脱色时类脂质被乙醇溶解，细 胞壁透性增大，结晶紫—碘的复合 物较易洗脱出来
三、器材 菌种大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物， 枯草芽孢杆菌12~24h营养琼脂斜面培养 物。 染色剂革兰氏染色液。 仪器或者其他用具显微镜，酒精灯，载玻 片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲 苯)，擦镜纸，生理盐水等
三、器材 ❖ 菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物， 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物， 枯草芽孢杆菌12～24h营养琼脂斜面培养 物。 ❖ 染色剂 革兰氏染色液。 ❖ 仪器或者其他用具 显微镜，酒精灯，载玻 片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲 苯），擦镜纸，生理盐水等
四、操作步骤 现场演示 ÷涂片涂成薄膜 干燥 自然干燥 固定 通过火焰2~3次结 晶紫初染1-2min碘液媒染1min乙醇脱色 至流 出的乙醇无紫色番红复染2min油镜镜检观察。 ÷混合涂片涂色按上述方法，在同一载玻片上，以 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较
❖ 涂片 涂成薄膜 干燥 自然干燥 固定 通过火焰2～3次 结 晶紫初染 1-2min 碘液媒染 1min 乙醇脱色 至流 出的乙醇无紫色 番红复染 2min 油镜镜检观察。 四、操作步骤 ❖混合涂片涂色 按上述方法，在同一载玻片上，以 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。 现场演示
紫色燃料 圆碘液 口酒精 回番红花红 a用紫色染料 结晶紫染色 b用碘液媒染 c用酒精脱色 d用番红花红复染
注意： 1载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚 ； 2热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏 细胞形态； 3染色时，每一步骤后都要立即水洗； 4革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰 氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌 被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染 成阴性菌，脱色时间一般20~30S
1 载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚； 2 热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏 细胞形态； 3 染色时，每一步骤后都要立即水洗； 4 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰 氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌 被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染 成阴性菌，脱色时间一般20～30S。 注意：
五、实验报告 结果 列表简述3株 细菌的染色 观察结果。 金黄色葡萄球菌(G) 变形杆菌(G) 画出各菌的形 状和革兰氏 染色颜色反 应。 枯草芽孢杆菌(G) 大肠杆菌(G)
五、实验报告 结果 列表简述3株 细菌的染色 观察结果。 画出各菌的形 状和革兰氏 染色颜色反 应。 金黄色葡萄球菌(G+ ) 大肠杆菌(G- 枯草芽孢杆菌(G ) + ) 变形杆菌(G- )
六、思考题 ·你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果 的正确性？其中最关键的环节是什么？ ÷现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的 粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。 你怎么运用大肠杆菌来证明结果的正确 性？ ÷热固定的目的是什么？
六、思考题 ❖ 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果 的正确性？其中最关键的环节是什么？ ❖ 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的 粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。 你怎么运用大肠杆菌来证明结果的正确 性？ ❖ 热固定的目的是什么？