上海交通大学：《生物技术与人类》通识课程教学资源（小论文）丝素蛋白的研究、制备和应用.doc_大学文库

reviews the application of silk fibroin as a biomaterial. Keywords:Silk Fibroin;Structure;Enzymatic Hydrolysis;Biomaterial 1丝素蛋白简介蚕丝是熟蚕结茧时所分泌的丝液凝固而成的连续长纤维，也称天然丝，是一种天然丝胶纤维，是人类利用最早的动物纤维之一。根丝据蚕的食物的不同，又分桑蚕、柞蚕、木薯图1蚕丝结构蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。蚕茧的化学组成主要为：水分1.40%，灰分1.14%，蛋白质97.34%，醚溶性浸出物0.26%，纤维 0.39%。茧丝由两根单丝构成，每根单丝主要是由纤维状蛋白质丝素蛋白，外包以另一种蛋白质丝胶蛋白粘结而成，此外还含少量油脂类、色素、无机物等，如图1 所示。其中丝素蛋白是一种角蛋白，是蚕丝的主体，约占蚕丝质量的70%~80%。丝素蛋白是一种无生理活性的天然生物大分子，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18 种氨基酸以多缩氨键连接而成，通常认为其分子量约为3.7×10。丝素蛋白在组成上由18种氨基酸构成，其中侧基较为简单的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占总组成的85%，三者的摩尔比为4：3：1，且按一定序列结构排列成较为规整的链段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域：而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非晶区域。除了C、H、O、N四种元素以外，丝素蛋白和其他蛋白一样，还含有多种其他元素。科学家用质子诱导X发射光谱对多种丝素蛋白进行研究，发现它还含有K、Ca、Si、Sr、P、Fe、Cu等元素，这些元素对丝素蛋白的性能有直接影响，和蚕吐丝的机理等也有着直接的关系，但具体的这些元素和丝素蛋白之间的相互关系在学界仍在探索之中。在结构上，丝素蛋白是一种亚单元结构，由一条H链（长链），一条L链（短链)和糖蛋白P25构成。丝素蛋白分子的构象可分为两类，分别为Si1kI和Si1k IⅡ结构。Si1kI结构包括无规则线团和a-螺旋，Si1kIⅡ结构为反平行U-折叠结构。 2017年刘永成、邵正中等用隧道扫描电镜(STM)得到了这两类构象及其中间状态的图像，如图2所示

reviews the application of silk fibroin as a biomaterial. Keywords: Silk Fibroin; Structure; Enzymatic Hydrolysis; Biomaterial 1 丝素蛋白简介蚕丝是熟蚕结茧时所分泌的丝液凝固而成的连续长纤维，也称天然丝，是一种天然纤维，是人类利用最早的动物纤维之一。根据蚕的食物的不同，又分桑蚕、柞蚕、木薯蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。蚕茧的化学组成主要为：水分 1.40%，灰分 1.14%，蛋白质 97.34%，醚溶性浸出物 0.26%，纤维 0.39%。茧丝由两根单丝构成，每根单丝主要是由纤维状蛋白质丝素蛋白，外包以另一种蛋白质丝胶蛋白粘结而成，此外还含少量油脂类、色素、无机物等，如图 1 所示。其中丝素蛋白是一种角蛋白，是蚕丝的主体 ,约占蚕丝质量的 70%～80%。丝素蛋白是一种无生理活性的天然生物大分子 ,由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等 18 种氨基酸以多缩氨键连接而成，通常认为其分子量约为 3.7×10 5。丝素蛋白在组成上由 18 种氨基酸构成，其中侧基较为简单的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占总组成的 85%，三者的摩尔比为 4：3：1，且按一定序列结构排列成较为规整的链段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域；而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非晶区域。除了 C、H、O、N 四种元素以外，丝素蛋白和其他蛋白一样，还含有多种其他元素。科学家用质子诱导 X 发射光谱对多种丝素蛋白进行研究，发现它还含有 K、Ca、Si、Sr、P、Fe、Cu 等元素，这些元素对丝素蛋白的性能有直接影响，和蚕吐丝的机理等也有着直接的关系，但具体的这些元素和丝素蛋白之间的相互关系在学界仍在探索之中。在结构上，丝素蛋白是一种亚单元结构，由一条 H 链(长链)，一条 L 链(短链)和糖蛋白 P25 构成。丝素蛋白分子的构象可分为两类，分别为 SilkⅠ和 Silk Ⅱ结构。SilkⅠ结构包括无规则线团和α-螺旋，SilkⅡ结构为反平行 U-折叠结构。 2017 年刘永成、邵正中等用隧道扫描电镜（STM）得到了这两类构象及其中间状态的图像，如图 2 所示。图 1 蚕丝结构

升)与溶解体系的质量（单位为克）的比为15，所得到的丝素蛋白溶液用去离子水透析，直到用AgNO溶液检测不到C1-为止，将透析后的溶液放在0~4℃条件下放置备用。 2.2LiBr溶解法 LiBr溶解法的溶解溶液可分为三种：一种是m(LiBr):m(CH,OH):m(H0) 的比为45：44：11；一种是m(LiBr):m(C2H0H)为40：60：一种是9.5mo1/L的 LiBr-H0水溶液。三种溶解体系都是在温度为4550℃下搅拌溶解丝素蛋白，丝素蛋白的质量与溶解体系的质量比为3：40，得到的丝素蛋白溶液先用去离子水透析3天，在用聚乙二醇水溶液浓缩6小时，得到高浓度的丝素蛋白水溶液。 2.3 LiSCN溶解法将脱胶后的丝素蛋白放入浓度为9mol/L的LiSCN溶液中搅拌至完全溶解，其中丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为30100，将得到的丝素蛋白溶液用去离子水或者是5mo1/L的尿素水溶液透析约2小时，得到丝素蛋白水溶液；或者是将丝素蛋白放入质量分数为6O%的LiSCN溶液中搅拌溶解，丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为100，溶解后的丝素蛋白溶液用20mmol/L的Tris-HC1和5mol/L的尿素水溶液透析，得到丝素蛋白水溶液。 2.4Ca(N0,),溶解法将脱胶后烘干的丝素蛋白放入Ca (NO)2CHOH-H20的体系中， m[Ca(NO)2·H0]:m(CHO)为3：1，加热溶解，至丝素蛋白完全溶解，然后用去离子水透析，的丝素蛋白水溶液。 2.5传统丝素蛋白膜制备方法中存在的问题传统方法制备过程中，需要的溶解体系主要为无机盐水溶液体系，并且操作工艺较为复杂，溶解后需要较长时间的透析，丝素蛋白分子容易降解并且溶解效果不好，得到的是一种容易发生凝胶的不稳定溶液体系，这些溶剂存在毒性高、不稳定、溶解耗时、破坏蛋白结构、难回收等缺点。在溶解过程中高浓度的盐溶液对丝素蛋白的结构破坏严重，使得所制得的再生丝素蛋白产品的机械性能较差

升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 15，所得到的丝素蛋白溶液用去离子水透析，直到用 AgNO3溶液检测不到 Cl-为止，将透析后的溶液放在 0~4℃条件下放置备用。 2.2 LiBr 溶解法 LiBr 溶解法的溶解溶液可分为三种：一种是 m（LiBr）：m（C2H5OH）：m（H2O）的比为 45:44:11；一种是 m（LiBr）: m（C2H5OH）为 40:60；一种是 9.5mol/L 的 LiBr- H2O 水溶液。三种溶解体系都是在温度为 45~50℃下搅拌溶解丝素蛋白，丝素蛋白的质量与溶解体系的质量比为 3:40，得到的丝素蛋白溶液先用去离子水透析 3 天，在用聚乙二醇水溶液浓缩 6 小时，得到高浓度的丝素蛋白水溶液。 2.3 LiSCN 溶解法将脱胶后的丝素蛋白放入浓度为 9mol/L 的 LiSCN 溶液中搅拌至完全溶解，其中丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 30~100，将得到的丝素蛋白溶液用去离子水或者是 5mol/L 的尿素水溶液透析约 2 小时，得到丝素蛋白水溶液；或者是将丝素蛋白放入质量分数为 60%的 LiSCN 溶液中搅拌溶解，丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 100，溶解后的丝素蛋白溶液用 20mmol/L 的 Tris-HCl 和 5mol/L 的尿素水溶液透析，得到丝素蛋白水溶液。 2.4 Ca(NO3)2溶解法将脱胶后烘干的丝素蛋白放入 Ca(NO3)2-CH3OH- H2O 的体系中， m[Ca(NO3)2·H2O]:m(CH3OH)为 3:1，加热溶解，至丝素蛋白完全溶解，然后用去离子水透析，的丝素蛋白水溶液。 2.5 传统丝素蛋白膜制备方法中存在的问题传统方法制备过程中，需要的溶解体系主要为无机盐水溶液体系，并且操作工艺较为复杂，溶解后需要较长时间的透析，丝素蛋白分子容易降解并且溶解效果不好，得到的是一种容易发生凝胶的不稳定溶液体系，这些溶剂存在毒性高、不稳定、溶解耗时、破坏蛋白结构、难回收等缺点。在溶解过程中高浓度的盐溶液对丝素蛋白的结构破坏严重，使得所制得的再生丝素蛋白产品的机械性能较差

从而影响丝素蛋白产品的应用，这就限制了丝素蛋白更为广泛的应用。 3酶水解法制备再生丝素蛋白膜传统的化学法制备丝素蛋白膜有以上缺点，故而科学家们研发出了另外一种作用条件比较温和的水解方法一一酶水解法。和化学法的酸、碱、盐溶解法相比，蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组成。而且由于酶的高度专一性，使得我们能根据不同的应用需要，来制备不同的多肽产品。 3.1溶剂对象按照水解作用的方式，可将蛋白酶划分为两大类，一是肽链端解酶（又称外切酶)，它从肽链骨架的一端逐个将氨基酸残基切下来，故它又可分为从羧基端开始的羧肽酶和从氨基端开始的氨肽酶；另一类是肽键内切酶，这类酶水解时从肽链的中间部位按照各自的特异性将肽键切断。显然，用内切酶水解大分子肽链时，更易得到小分子肽片段。为此，我们在酶水解法制再生丝素蛋白膜实验中，均挑选内切酶作为溶剂对象。 3.2酶水解法的过程用酶水解法制备丝素蛋白膜的提取工艺流程与传统方法几乎相同，区别仅在于水解过程中溶剂的配制与使用过程不同。首先经过初步溶解和透析得到再生丝素液，然后配制酶母液。用万分之一克电子天平准确称取所需酶制剂，用其活性相应p的缓冲液溶解。为保证其活力，临用前配制。酶液的浓度以所加酶液体积不影响反应的总体积为标准进行适当调整。将一定浓度的再生丝素液和相应缓冲液混合，微调至反应H值和反应所需温度后加入酶母液进行反应。当反应到达预定时间后，迅速煮沸使酶失活。然后再经过进一步的提纯过滤、灭菌、烘干，最终得到再生丝素蛋白膜成品。 4丝素蛋白的功能与应用 4.1丝素蛋白的优点 Altman等在2009年的研究中提出，丝素蛋白有如下优点： (1)与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；

从而影响丝素蛋白产品的应用，这就限制了丝素蛋白更为广泛的应用。 3 酶水解法制备再生丝素蛋白膜传统的化学法制备丝素蛋白膜有以上缺点，故而科学家们研发出了另外一种作用条件比较温和的水解方法——酶水解法。和化学法的酸、碱、盐溶解法相比，蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组成。而且由于酶的高度专一性，使得我们能根据不同的应用需要，来制备不同的多肽产品。 3.1 溶剂对象按照水解作用的方式,可将蛋白酶划分为两大类,一是肽链端解酶(又称外切酶),它从肽链骨架的一端逐个将氨基酸残基切下来,故它又可分为从羧基端开始的羧肽酶和从氨基端开始的氨肽酶;另一类是肽键内切酶,这类酶水解时从肽链的中间部位按照各自的特异性将肽键切断。显然,用内切酶水解大分子肽链时,更易得到小分子肽片段。为此,我们在酶水解法制再生丝素蛋白膜实验中,均挑选内切酶作为溶剂对象。 3.2 酶水解法的过程用酶水解法制备丝素蛋白膜的提取工艺流程与传统方法几乎相同，区别仅在于水解过程中溶剂的配制与使用过程不同。首先经过初步溶解和透析得到再生丝素液，然后配制酶母液。用万分之一克电子天平准确称取所需酶制剂,用其活性相应 pH 的缓冲液溶解。为保证其活力,临用前配制。酶液的浓度以所加酶液体积不影响反应的总体积为标准进行适当调整。将一定浓度的再生丝素液和相应缓冲液混合，微调至反应 pH 值和反应所需温度后加入酶母液进行反应。当反应到达预定时间后，迅速煮沸使酶失活。然后再经过进一步的提纯过滤、灭菌、烘干，最终得到再生丝素蛋白膜成品。 4 丝素蛋白的功能与应用 4.1丝素蛋白的优点 Altman 等在 2009 年的研究中提出，丝素蛋白有如下优点： (1)与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；

(②)具有良好的生物相容性，可以用来做细胞培养基质： (3)可以通过不同处理方法获得膜或其他形态，而且工艺相对简单： (4)可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能： (⑤)在体内外可以缓慢降解： (6)对生物体无危险性。 4.2丝素蛋白的应用研究丝纤维作为纺织纤维应用有几千年的历史，被用于临床上如用作手术缝合线等，也已经有几十年的历史。研究表明，丝素蛋白具有良好的生物相容性、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解。因此，众多学者致力于研究开拓丝素蛋白应用的新领域，对它作为食品添加剂和在化妆品上的应用都进行了广泛的探讨与研究。近年来，随着科学家们逐渐发现丝素蛋白有更多潜力，丝素蛋白开始被更多应用于生物传感、生物医学材料、软组织相容材料和组织工程等领域。 4.2.1生物酶防护剂有机磷农药可通过有机磷酸酯与体内的胆碱酯酶结合成稳定的磷酸化胆碱酯酶，从而抑制人体内胆碱酯酶的活性，使神经正常活动所产生的乙酰胆碱不能随即分解而致人中毒和死亡。因此首先在体外用酶与毒剂发生反应，使之丧失进入体内进行破坏的能力，是一条有效的防毒途径。杨旭红等以乙酰胆碱酯酶为解毒酶，丝素蛋白溶液为酶载体，处理得到的织物具有良好的防毒效果，并且在温度合适的条件下可保存较长的时间。而以蒸馏水为酶载体时，同样可使织物获得良好的防毒效果，但其防毒效果随着时间的增加而变差。这说明用丝素蛋白溶液作材料合成的生物酶防护剂时，可直接和有毒物质（有机磷酸酯）发生反应，结合成稳定的磷酰化胆碱酯酶而阻断毒剂对人体的侵害。 4.2.2药物控制释放材料陈建勇等用丝素膜包埋5-氟尿嘧啶(5-FU),在不同pH值下测定了丝素5-U 复合膜中药物的释放情况。结果表明丝素膜可作为5-FU载体，均匀地包埋5-FU。由于丝素涂层的保护，复合膜中的5-FU溶解释放速度变慢，释放时间延长。李明忠等采用冷冻干燥法制得多孔结构的丝素膜，膜中大量毛细管的存在大大提高丝素膜的透气、透湿性，多孔的存在也有助于药物的控制释放

(2)具有良好的生物相容性，可以用来做细胞培养基质； (3)可以通过不同处理方法获得膜或其他形态，而且工艺相对简单； (4)可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能； (5)在体内外可以缓慢降解； (6)对生物体无危险性。 4.2 丝素蛋白的应用研究丝纤维作为纺织纤维应用有几千年的历史，被用于临床上如用作手术缝合线等，也已经有几十年的历史。研究表明，丝素蛋白具有良好的生物相容性、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解。因此，众多学者致力于研究开拓丝素蛋白应用的新领域，对它作为食品添加剂和在化妆品上的应用都进行了广泛的探讨与研究。近年来，随着科学家们逐渐发现丝素蛋白有更多潜力，丝素蛋白开始被更多应用于生物传感、生物医学材料、软组织相容材料和组织工程等领域。 4.2.1 生物酶防护剂有机磷农药可通过有机磷酸酯与体内的胆碱酯酶结合成稳定的磷酸化胆碱酯酶，从而抑制人体内胆碱酯酶的活性，使神经正常活动所产生的乙酰胆碱不能随即分解而致人中毒和死亡。因此首先在体外用酶与毒剂发生反应，使之丧失进入体内进行破坏的能力，是一条有效的防毒途径。杨旭红等以乙酰胆碱酯酶为解毒酶，丝素蛋白溶液为酶载体，处理得到的织物具有良好的防毒效果，并且在温度合适的条件下可保存较长的时间。而以蒸馏水为酶载体时，同样可使织物获得良好的防毒效果，但其防毒效果随着时间的增加而变差。这说明用丝素蛋白溶液作材料合成的生物酶防护剂时，可直接和有毒物质(有机磷酸酯)发生反应，结合成稳定的磷酰化胆碱酯酶而阻断毒剂对人体的侵害。 4.2.2 药物控制释放材料陈建勇等用丝素膜包埋 5-氟尿嘧啶(5-FU)，在不同 pH 值下测定了丝素 5- FU 复合膜中药物的释放情况。结果表明丝素膜可作为 5-FU 载体，均匀地包埋 5-FU。由于丝素涂层的保护，复合膜中的 5-FU 溶解释放速度变慢，释放时间延长。李明忠等采用冷冻干燥法制得多孔结构的丝素膜，膜中大量毛细管的存在大大提高丝素膜的透气、透湿性，多孔的存在也有助于药物的控制释放

4.2.3仿生材料吴徵宇等用丝素膜制成“人造皮肤”创面保护膜和新鲜猪皮在兔身上作对比试验，结果显示丝素膜的各项性能均优于猪皮。在深Ⅱ度创面和浅Ⅱ度创面临床试验中，丝素蛋白膜表现出良好的透湿性和与创面的粘附性，促进了创面愈合。张幼珠等研制成了一种含抗菌药物的丝素膜，它兼有局部应用抗菌药物和作为创面覆盖膜的优点，可以用于烧伤感染创面，能有效地控制创面感染而促进创面愈合。 4.2.4组织工程材料目前在组织工程中使用的合成高分子材料，它们在降解性等方面都基本上能满足支架材料的应用，但在生物相容性和细胞粘附能力方面却远不如天然高分子。支架材料的生物相容性和细胞粘附能力是至关重要的。丝素蛋白作为一种具有优良生物相容性的天然高分子材料受到青睐。近年来运用丝蛋白对一些生物高分子材料进行改性也引起了研究人员的广泛关注。 5小结与展望丝素蛋白是从蚕茧中脱除丝胶得到的一种蛋白质，具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞无毒性等特点，越来越多地应用于生物医药等领域。天然丝素膜是在家蚕或柞蚕吐丝前，直接从后部丝腺收集液状丝素制得。再生丝素膜的制备，一般包括蚕丝脱胶，丝素水解，透析，成膜4个过程。根据研究目的不同，具体的制备方法也不同，主要表现在丝素水解时溶剂的选择上。常用的丝素水解方法有传统化学法和酶溶解法，其中蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组成。自从发现丝素蛋白具有独特的物理化学性质和对人体有良好的相容性以来，它作为食品添加剂和在化妆品上的应用已进行了广泛的研究。而近年来，科学家们逐渐发现丝素蛋白有更多潜力，丝素蛋白的应用不仅在传统领域有了新的进展，在生物医学材料、软组织相容材料、组织工程等领域也逐渐蓬勃发展起来。在未来，随着丝素蛋白应用领域的不断拓宽，丝素作为一种生物相容性良好、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解的天然高分子蛋白质，将有更广阔的应用前景

4.2.3 仿生材料吴徵宇等用丝素膜制成“人造皮肤”创面保护膜和新鲜猪皮在兔身上作对比试验，结果显示丝素膜的各项性能均优于猪皮。在深Ⅱ度创面和浅Ⅱ度创面临床试验中，丝素蛋白膜表现出良好的透湿性和与创面的粘附性，促进了创面愈合。张幼珠等研制成了一种含抗菌药物的丝素膜，它兼有局部应用抗菌药物和作为创面覆盖膜的优点，可以用于烧伤感染创面，能有效地控制创面感染而促进创面愈合。 4.2.4 组织工程材料目前在组织工程中使用的合成高分子材料，它们在降解性等方面都基本上能满足支架材料的应用，但在生物相容性和细胞粘附能力方面却远不如天然高分子。支架材料的生物相容性和细胞粘附能力是至关重要的。丝素蛋白作为一种具有优良生物相容性的天然高分子材料受到青睐。近年来运用丝蛋白对一些生物高分子材料进行改性也引起了研究人员的广泛关注。 5 小结与展望丝素蛋白是从蚕茧中脱除丝胶得到的一种蛋白质，具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞无毒性等特点，越来越多地应用于生物医药等领域。天然丝素膜是在家蚕或柞蚕吐丝前，直接从后部丝腺收集液状丝素制得。再生丝素膜的制备，一般包括蚕丝脱胶，丝素水解，透析，成膜 4 个过程。根据研究目的不同, 具体的制备方法也不同，主要表现在丝素水解时溶剂的选择上。常用的丝素水解方法有传统化学法和酶溶解法，其中蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组成。自从发现丝素蛋白具有独特的物理化学性质和对人体有良好的相容性以来，它作为食品添加剂和在化妆品上的应用已进行了广泛的研究。而近年来，科学家们逐渐发现丝素蛋白有更多潜力，丝素蛋白的应用不仅在传统领域有了新的进展，在生物医学材料、软组织相容材料、组织工程等领域也逐渐蓬勃发展起来。在未来，随着丝素蛋白应用领域的不断拓宽 ,丝素作为一种生物相容性良好、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解的天然高分子蛋白质，将有更广阔的应用前景