第十一章 高致液相 色 Highi Performance Liquid Chromatography, HPLC
High Performance Liquid Chromatography, HPLC 第十一章 高效液相色谱
高效液相色谱(PLC)是以溶剂液体为流动相的色 谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸 附色谱（液固色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝 胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱（薄层 色谱)等。 早期液相色谱，包括Tswett,都是在直径15cm, 长50500cm的玻璃柱中进行。为保证有一定的柱流 速，填充的固定相颗粒直径多在150200u范围内。即 使这样，流速仍然很低(K1 mL/min),分析时间仍然很 长 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 2 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色 谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸 附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝 胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层 色谱)等。 早期液相色谱，包括Tswett，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行。为保证有一定的柱流 速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即 使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很 长
当加压增加流速（真空或空气泵）时，尽管分析时间 减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说 柱效下降了。(H=A+CU) 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到： 最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的 粒径(3~10μm)! 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、 高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才 彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高 效液相色谱技术才真正得到广泛应用。 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 3 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间 减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说 柱效下降了。（H=A+CU） 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到： 最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的 粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、 高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才 彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高 效液相色谱技术才真正得到广泛应用
HPLC特点 分离系统也由两相 固定相和流动相组成 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学 键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液 膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相 是各种溶剂。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附 能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸 大小的差异进行分离。 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 4 一 、HPLC特点 分离系统也由两相——固定相和流动相组成 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学 键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液 膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相 是各种溶剂。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附 能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸 大小的差异进行分离
经典液相色清法 概述 液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称~。 ·经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 5 经典液相色谱法 概述 液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短
液相色谱与气相色谱的比较 相同点：液相色谱所用基本概念：保留值、塔板 数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一 志 液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率 方程也与气相色谱基本一致。 是 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 6 液相色谱与气相色谱的比较 相同点：液相色谱所用基本概念：保留值、塔板 数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一 致。 液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率 方程也与气相色谱基本一致
不同点：（1)应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化 而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发 性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及 高聚物的分离、分析较为困难。 液相色谱测不受样品挥发度和热稳定性 的限制，它非常适合分子量较大、难气化、 不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物 及高聚物的分离分析。 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 7 不同点：（1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化 而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发 性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及 高聚物的分离、分析较为困难。 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性 的限制，它非常适合分子量较大、难气化、 不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物 及高聚物的分离分析
由于HPLC分离分析的高灵敏 极性增加 度、定量的准确性、适于非挥 不溶于水 溶于水 非极性 离子 发性和热不稳定组分的分析， 非离子极性 因此，在工业、科学研究，尤 分配 其是在生物学和医学等方面应 102 吸附 用极为广泛。如氨基酸、蛋白 反向分配 正向分配 离子交换 质、核酸、烃、碳水化合物、 103 药品、多糖、高聚物、农药、 抗生素、胆固醇、金属有机物 分子量 等分析，大多是通过HPLC来 104 完成的。 尺寸排粗 右图是各种HPLC方法的应 105 凝胶渗透 凝胶过滤 用范围及对象 105 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 8 由于HPLC分离分析的高灵敏 度、定量的准确性、适于非挥 发性和热不稳定组分的分析， 因此，在工业、科学研究，尤 其是在生物学和医学等方面应 用极为广泛。如氨基酸、蛋白 质、核酸、烃、碳水化合物、 药品、多糖、高聚物、农药、 抗生素、胆固醇、金属有机物 等分析，大多是通过HPLC来 完成的。 右图是各种HPLC方法的应 用范围及对象 极性增加 不溶于水 溶于水 非极性 离子 非离子极性 吸附 反向分配 分配 正向分配 离子交换 尺寸排阻 凝胶渗透 凝胶过滤 分 子 量
(2) 液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程。 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺 样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 液相色谱固定相类型多，作为分析时选 择余地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温 度，一般有利于色谱分离条件的选择。 2011/12/27 石河子大学化学化工学院
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 9 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程。 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺 样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 液相色谱固定相类型多，作为分析时选 择余地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温 度，一般有利于色谱分离条件的选择
(3)液相色谱中制备样品简单， 回收样品也 比较容易，而且回收是定量的，适合于大量 制备。 缺点：液相色谱尚缺乏通用的检测器， 仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中， 这两种色谱技术是互相补充的。 2011/12/27 石河子大学化学化工学院 10
2011/12/27 石河子大学化学化工学院 10 （3）液相色谱中制备样品简单，回收样品也 比较容易，而且回收是定量的，适合于大量 制备。 缺点：液相色谱尚缺乏通用的检测器， 仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中， 这两种色谱技术是互相补充的