石河子大学化学化工学院 教案 开课单位：化学化工学院 课程名称：分析化学（二) 专业年级：药学、中药专业 任课教师：赵芳 教材名称：分析化学
石河子大学化学化工学院 教 案 开课单位：化学化工学院 课程名称：分析化学（二） 专业年级：药学、中药专业 任课教师： 赵 芳 教材名称： 分析化学
学年第 学期 荧光分析法 课时安排4学时 教学 掌握荧光分析法、磷光分析法、基本原理及其应用，了解荧光分析仪器， 要求 的基本构造。 教学 教学重点：荧光分析法的基本原理及其应用。 重点 难点 教学难点：荧光分析法的基本原理及其仪器设备的原理。 教学 方 多媒体课件，以讲授为主 手段 第一节荧光分析法 的 概述 基本原理 容 荧光分析仪器 提 四、 荧光分析法的应用 纲
2 学年第 学期 授课 内容 荧光分析法 课时安排 4 学时 教学 目的 要求 掌握荧光分析法、磷光分析法、基本原理及其应用，了解荧光分析仪器， 的基本构造。 教学 重点 难点 教学重点：荧光分析法的基本原理及其应用。 教学难点：荧光分析法的基本原理及其仪器设备的原理。 教学 方法 手段 多媒体课件，以讲授为主 教 学 内 容 提 纲 第一节 荧光分析法 一、 概述 二、 基本原理 三、 荧光分析仪器 四、 荧光分析法的应用
课外 学习 理解并掌握本章所讲内容，完成课后思考题2、3、5、7。 要求 荧光分析法 1概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种 分析方法。 16世纪己经发现荧光，但没有人能解释该现象，到1852年斯托克斯解释：是由于物 质吸收了光能后发射出来的分子荧光。1864年，他建立了荧光分析手段。20世纪，发展 迅速。 与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。 荧光分析法已经在药物、临床、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域。 2基本原理 2.1分子荧光的产生 处于各激发态不同振动能级上分子，通过无辐射跃迁，释放一部分能量跃回 到第一激发态的最低振动能级上，再以辐射跃迁形式回到基态的各振动能极上， 产生分子荧光。 3
3 课外 学习 要求 理解并掌握本章所讲内容，完成课后思考题 2、3、5、7。 教学 后记 荧光分析法 1 概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种 分析方法。 16 世纪已经发现荧光，但没有人能解释该现象，到 1852 年斯托克斯解释：是由于物 质吸收了光能后发射出来的分子荧光。1864 年，他建立了荧光分析手段。20 世纪，发展 迅速。 与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。 荧光分析法已经在药物、临床、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域。 2 基本原理 2.1 分子荧光的产生 处于各激发态不同振动能级上分子，通过无辐射跃迁，释放一部分能量跃回 到第一激发态的最低振动能级上，再以辐射跃迁形式回到基态的各振动能极上， 产生分子荧光
VR VR:vibration relaxation isc:intersystem croosing VR ic:interna conversior So 1=0 图5-1分子内的光物理过程 A1,A2-吸收F.荧光P.磷光iC-内转化isc-体系窜跃VR-振动弛豫 2.2荧光效率及其影响因素 (1)荧光效率 荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总的比值即： 荧光效率(？)=激发态分子数 发荧光分析数 (5-1) 若以各种跃迁的速率常数来表示，则 4,“K+zK (5-2) K为荧光发射过程中的速率常数ΣK,非辐射跃迁的速率常数之和 (2)荧光与分子结构的关系 ①.必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大，电子的离域性越 强，越容易被激发产生荧光：大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随 共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。 ②.分子的刚性平面结构有利于荧光的产生 ③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：OH、NH2、NR2和OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强。 吸电子基团：-COOH、NO和-NO2等使荧光减弱。 随着卤素取代基中卤原子系数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光 4
4 2.2 荧光效率及其影响因素 （1）荧光效率 荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总的比值即： f = 发荧光分析数 荧光效率（ ） 激发态分子数 （5－1） 若以各种跃迁的速率常数来表示，则 f f f i K K K = + （5－2） Kf 为荧光发射过程中的速率常数 Ki 非辐射跃迁的速率常数之和 （2）荧光与分子结构的关系 ①. 必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大, 电子的离域性越 强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随 共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。 ②.分子的刚性平面结构有利于荧光的产生 ③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH、-NH2、-NR2 和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。 吸电子基团：-COOH、-NO 和-NO2 等使荧光减弱。 随着卤素取代基中卤原子系数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光 S2 v=0 1 v=0 1 2 S1 VR ic VR isc VR 2 1 v=0 T1 A2 A1 F ic p isc v=0 1 2 3 1 2 3 S0 图 5-1 分子内的光物理过程 A1，A2-吸收 F-荧光 P-磷光 ic-内转化 isc-体系窜跃 VR-振动弛豫 VR: vibration relaxation isc: intersystem croosing ic: internal conversion 4 2
增强。 (3)环境因素对荧光的影响 溶剂极性对荧光强度的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移， 荧光强度增大。奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。 温度荧光强度的影响：一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变， 而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。因此，对大多数的荧光物质而言，升高温 度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长， 温度对于磷光的影响比荧光更大。 溶液的pH值影响：共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧 光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。 另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对 处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。 2.3荧光强度与溶液浓度的关系 根据荧光效率的定义，荧光强度山应为所吸收的辐射强度。与荧光效率p的乘积： 1=pl。=p(1。-) A=g号 1=1.10 可得： 1=p1(1-10) 1=9234-230-230】 21 3到 如果溶液很稀，吸光度A<0.05,方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则 上式可简化为： 1=2.3p,1nA=2.30,1bc 可见，当A<0.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系 数和溶液的浓度成正比。对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与 溶液的浓度有关： I,=Kc(定量分析依据) 荧光猝灭 5
5 增强。 （3）环境因素对荧光的影响 溶剂极性对荧光强度的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移， 荧光强度增大。奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为 1、30 和 1000。 温度荧光强度的影响：一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变， 而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。因此，对大多数的荧光物质而言，升高温 度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长， 温度对于磷光的影响比荧光更大。 溶液的 pH 值影响：共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧 光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。 另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对 处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。 2.3 荧光强度与溶液浓度的关系 根据荧光效率的定义，荧光强度 If 应为所吸收的辐射强度 Ia 与荧光效率 f 的乘积： ( ) 0 I I I I f = f a = f − I I A 0 = lg A I I − = •10 0 可得： I ( 10 ) f 0 A f I I − = − − − − = − 3! ( 2.3 ) 2! ( 2.3 ) I 2.3 2 3 f 0 A A f I A 如果溶液很稀，吸光度 A 0.05，方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则 上式可简化为： I I A I bc f = 2.3 f 0 = 2.3 f 0 可见，当 A 0.05 时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系 数和溶液的浓度成正比。对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与 溶液的浓度有关： I Kc f = （定量分析依据） 荧光猝灭
荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率下 降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭一M+激→M M+Q一M+Q+热 自熄灭一荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。 3荧光分析仪器 由光源、单色器、液池、检测器和记录系统五部分组成。 3.1光源：激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度：适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源。荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯。3.2单色器：荧 光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。大多数荧光光度计 一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获 得荧光光谱。第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长，x,用此激 发光激发液池内的荧光物质入x.第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰 光，用来选择测定用的荧光波长入m。在选定的入em下测定荧光强度，定量分析。 3.3样品池：盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最 上边。 3.4检测器：把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度。荧光的强度一般较弱， 要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有 高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧 光强度。 3.5读出装置记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱 4荧光分析法的应用 4.1无机化合物分析 单独的无机离子很少发荧光，大多数是利用无机离子与有机试剂形成有荧光 的络合物，目前采用有机试剂进行荧光分析的元素己近70种，其中较常见的元 素有铍、铝、硼、镓及某些稀土元素等。 能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。它们 通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元或六元环的整合物。由于鳌 合物的形成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发光或发光较弱的化合物转变为强荧 6
6 荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率 f 下 降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭—— M + 激 → M* M* + Q → M + Q +热 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。 3 荧光分析仪器 由光源、单色器、液池、检测器和记录系统五部分组成。 3.1 光源：激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽。 荧光计中，常使用卤钨灯作光源。荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯。3.2 单色器：荧 光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。大多数荧光光度计 一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获 得荧光光谱。第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长 ex，用此激 发光激发液池内的荧光物质 ex。第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰 光，用来选择测定用的荧光波长 em。 在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析。 3.3 样品池：盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最 上边。 3.4 检测器：把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度。荧光的强度一般较弱， 要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有 高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧 光强度。 3.5 读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱 4 荧光分析法的应用 4.1 无机化合物分析 单独的无机离子很少发荧光，大多数是利用无机离子与有机试剂形成有荧光 的络合物，目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近 70 种，其中较常见的元 素有铍、铝、硼、镓及某些稀土元素等。 能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。它们 通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元或六元环的鳌合物。由于鳌 合物的形成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发光或发光较弱的化合物转变为强荧
光化合物。 PH=3.0时与Ca2+形成发射黄色光荧光的物质：安息香在碱性介质中与硼酸盐形成发 射绿蓝色荧光的络合物，与Z2+形成发射绿色荧光：桑色素在碱性溶液中与B2+形成发 射黄绿色荧光的络合物。 荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子缔合物。 另外是利用荧光猝灭法测定。间接测定Ag*、F、SO2、Fe3+等。 4.2有机化合物的分析 (1)脂肪族的有机化合物的分子结构比较简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些 试剂反应后才能进行荧光分析。 (2)芳香族有机化合物因其具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可以直接用荧光 法测定。为了提高灵敏度，有时候也将芳香族化合物与适当的试剂反应之后再进行测定
7 光化合物。 PH=3.0 时与 Ca2+形成发射黄色光荧光的物质；安息香在碱性介质中与硼酸盐形成发 射绿蓝色荧光的络合物，与 Zn2+形成发射绿色荧光；桑色素在碱性溶液中与 Be2+形成发 射黄绿色荧光的络合物。 荧光分析 中常用的另一类络合物是三元离子缔合物。 另外是利用荧光猝灭法测定。间接测定 Ag+、F -、SO2-、Fe3+等。 4.2 有机化合物的分析 （1）脂肪族的有机化合物的分子结构比较简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些 试剂反应后才能进行荧光分析。 （2）芳香族有机化合物因其具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可以直接用荧光 法测定。为了提高灵敏度，有时候也将芳香族化合物与适当的试剂反应之后再进行测定