西北农林科技大学 emistne 生物，司 动物科技学院生物化学课程组 第四节蛋白质的理化性质 及其分高苑化 返回到章
生物 化学 动物科技学院生物化学课程组 西北农林科技大学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 返回到章
生物 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分高纯化 返回到章 理化性质 酸碱性质 蛋白质的酸碱性质和等电点 分子量 蛋白质具有两性解离的性质。 3 胶体性质 蛋白质的等电点是指使蛋白质所带电荷 紫外吸收 为零时溶液的pH。 变性作用 将盐浓度为零时的等电点，称为等离子 (6 化学反应 点。它是蛋白质的特征参数。 2分离纯化 等电点的测定采用等电聚焦电泳。 3分浙鉴定 等电点时蛋白质的溶解度最小
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质的酸碱性质和等电点 蛋白质具有两性解离的性质。 蛋白质的等电点是指使蛋白质所带电荷 为零时溶液的pH。 将盐浓度为零时的等电点，称为等离子 点。它是蛋白质的特征参数。 等电点的测定采用等电聚焦电泳。 等电点时蛋白质的溶解度最小。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6) 返回到章
芝物 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分高轮化 理化性质 酸碱性质 MG 分子量 97,400 胶体性质 66,200 紫外吸收 45,000 变性作用 化学反应 2分离纯化 31,000 3分析鉴定 21,500 3
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质的分子量 化学组成法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法 c c R T Mr 0 lim → = 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6)
生物 第四节蛋白质的理化性质 及其分庸轮化 选择性沉淀蛋白质的方法 理化性 ①盐析法：大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4 NaC],使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 酸碱性 ②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数， 分子 PEG、丙酮、乙醇等 胶体性 4 紫外吸 ③重金属盐沉淀：pH>p时带负电荷，与重金属 离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+等)结成不溶性沉淀 变性作 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时， 化学反 蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 2分离纯以 子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味 3分析鉴 酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法
生物 化学 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， 不能通过半透膜） 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： ①水化膜； ②同种电荷的互相排斥； ③布郎运 动 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件，影响 蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 选择性沉淀蛋白质的方法 ： ①盐析法: 大量的中性盐[(NH4 )2SO4、Na2SO4、 NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数， PEG、丙酮、乙醇等 ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属 离子（Hg2+ 、Pb2+ 、Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时， 蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味 酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6)
物 第四节蛋白质的理化性质 及其分高充化 理化性质 酸碱性质 蛋白质紫外吸收 (2 分子量 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 胶体性质 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 紫外吸收 这三种氨基酸的在280nm附近有最大 变性作用 吸收，使得大多数蛋白质在280nm附 (6 化学反应 近显示强的吸收。 2分离纯化 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 3 分析鉴定
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附 近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6)
生物 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分膏轮化 理化性质 蛋蛋白质变性、沉淀与凝固 酸碱性质 变性后的蛋白质由于疏水基团 分子量 的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 胶体性质 质不一定都是变性后的蛋白质。 等 紫外吸收 2蛋 有些变性蛋白质在一定条件下还 变性作用 (6 化学反应 以复性，是可逆变性。 2分离纯化 抗 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 3分析鉴定 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 定发生变性
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质的变性作用(denaturation) 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构状 态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理 活性丧失，称为蛋白质的变性。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 不涉及肽键的断裂。 引起蛋白质变性的因素 ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 辐射、超声波、机械剪切等； ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重 金属盐等。 变性蛋白质的性质改变： ① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降， 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失， 抗原性改变。 蛋白质变性、沉淀与凝固 变性后的蛋白质由于疏水基团 的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 质不一定都是变性后的蛋白质。 有些变性蛋白质在一定条件下还 可以复性，是可逆变性。 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 一定发生变性。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6)
芝物 第四节蛋白质的理化性质 及其分高轮化 理化性质 化学反应 酸碱性质 黄色反应 由硝酸与氨基酸的萎基 2 分子量 氢酸和丙氨酸)反应生成硝基 胶体性质 物而显黄。 紫外吸收 变性作用 美賽餐子貌屎 用 缩脲能够与碱性硫酸铜作 化学反应 铜缩脲络合物 机为双缩尿应。 2分离纯化 病个以上肽键的多 与这缩脲 3分析鉴定 结构特 发生最孱爱， 红色或蓝紫色络合物。 这是多肽定量 测定的重要友应
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 化学反应 黄色反应，由硝酸与氨基酸的苯基（酪 氨酸和苯丙氨酸）反应生成二硝基苯衍生 物而显黄色。 多肽的双缩脲反应：双缩脲是两分子的尿 素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色 的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含 有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相 似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生 成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量 测定的重要反应。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应 (1) (2) (3) 1 (4) (5) (6)
生 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分膏轮化 4、浓缩与保存 理化性质 浓缩方法： 保存方法： 2 分离纯化 ①晶体保存： 原则 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否 方法 结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是 3分析鉴定 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容 易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温 度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ②冻干粉保存： ③溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油)后-20~-70℃保存
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 分离纯化蛋白质的一般原则 分离和纯化蛋白质就是要增加制品的 纯度或比活性。 一般流程为：前处理、粗分级、细分级、 浓缩与保存 分离纯化 电泳 前 处 理 粗 分 离 细 分 离 生物组织 无细胞提取液 破碎、溶解、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交 换层析 精制后蛋白质保存 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附 层析 1、前处理： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超 声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液， 研磨、 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分 在不同离心力下沉降的细胞组分 ③如果提取膜蛋白： 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介 质提取。 2、粗分级： 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法 （盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法 ④热处理选择性沉淀法 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性 沉淀法 3、细分级： ①透析除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸 附层析、亲和层析、疏水层析 电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电 泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳 离心法：密度梯度离心 4、浓缩与保存 浓缩方法： 保存方法： ①晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否 结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容 易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温 度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ②冻干粉保存： ③溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。 分析鉴定 理化性质 原则 方法 (1) (2) 1
芝物 第四节蛋白质的理化性质 化 及其分高轮化 理化性质 2分离纯化 蛋白质分离纯化常用方法的依据 原则 根据蛋白质的溶解度分离 方法 根据电荷差异分离 用差 根据分子大小分离 ② 根据配体特性异性分离 电泳 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异 膜分离 分析鉴定
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质分离纯化常用方法的依据 根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异 分离纯化 分析鉴定 理化性质 原则 方法 利用差异 沉淀 电泳 层析 离心 膜分离 (1) (2) 1 ④ ⑤ ⑥ ① ② ③
生物 第四节蛋白质的理化性质 化学 及其分膏轮化 理化性质 2 分离纯化 蛋白质沈淀 原则 等电点沉淀 方法 不同的蛋白质有不同的等电点，蛋白质在 利用差异 等电点处，净电荷为零，溶解度最低。所以 沉淀 通过改变溶液的pH值，可以使不同等电点 电泳 的蛋白质分别沉淀出来。 层粉 在蛋白质盐析、有机溶剂沉淀时，通常将 溶液的pH调到期等电点处。 膜分离 3 分析鉴定
生物 化学 第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 蛋白质沉淀 盐溶与盐析 盐溶：在较低的盐浓度下蛋白质溶解度增 大的现象，称为盐溶。 盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 以破坏蛋白质表面的双电层，使蛋白质从溶 液中沉淀析出，称为盐析。 在分离蛋白质时通常利用盐溶促进蛋白 质转移到溶液中，然后利用盐析使蛋白质从 溶液中沉淀出来。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫 酸钠等。 分离纯化 分析鉴定 理化性质 原则 方法 利用差异 沉淀 电泳 层析 离心 膜分离 蛋白质沉淀 有机溶剂沉淀 与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、 甲醇、丙酮等，可使蛋白质沉淀。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电 常数降低，蛋白质溶解度降低。 有机溶剂分级沉淀：不同的蛋白质对于不 同浓度不同比例有机溶剂的敏感度不同，所 以通过改变有机溶剂的比例和浓度可以将不 同的蛋白质分别沉淀出来。 有机溶剂沉淀蛋白质时在低温下进行。 蛋白质沉淀 等电点沉淀 不同的蛋白质有不同的等电点，蛋白质在 等电点处，净电荷为零， 溶解度最低。所以 通过改变溶液的pH值，可以使不同等电点 的蛋白质分别沉淀出来。 在蛋白质盐析、有机溶剂沉淀时，通常将 溶液的pH调到期等电点处。 (1) (2) 1 ④ ⑤ ⑥ ① ② ③