西北农林科技大学 emistre 生物和，司 动物科技学院生物化学课程组 第六节酶的分离苑化 及其活性测定
生物 化学 动物科技学院生物化学课程组 西北农林科技大学 第六节 酶的分离纯化 及其活性测定
第之节醉的少高纯化及共活性测定 分离纯化 目的 目的 2 过程与方法 3 注意事顶 研究酶的理化性质，包括结构与功能、 2 舌性测定 生物学作用、对酶鉴定。纯酶作为生化 试剂及用作药物的酶（纯度高）等
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 目的 研究酶的理化性质，包括结构与功能、 生物学作用、对酶鉴定。纯酶作为生化 试剂及用作药物的酶(纯度高)等。 分离纯化 活性测定 目的 过程与方法 注意事项 1 (1) (2) (3)
生物 化学 第之节醉的分膏纯化及共活性测突 分离纯化 过程与方法 目的 过程与方法 抽提 注意事顶 低温下，用水或低盐缓冲液抽提酶，含 活性测定 杂质多。 分离提纯 常用的方法：盐析、有机溶剂沉淀、层 析技术、电泳、超速离心等。 保存 将酶制品浓缩，结晶，以便保存
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 过程与方法 选材： 动物、植物或微生物，要求含酶 量高，易分离，经济，取材方便 破碎细胞 分离纯化 活性测定 目的 过程与方法 注意事项 研磨 匀浆 捣碎机 超声波 溶菌酶 化学溶剂 (甲苯) 纤维 素酶 提取液 动物 细菌 植物 抽提 低温下，用水或低盐缓冲液抽提酶，含 杂质多。 分离提纯 常用的方法：盐析、有机溶剂沉淀、层 析技术、电泳、超速离心等。 保存 将酶制品浓缩，结晶，以便保存 1 (1) (2) (3)
第之节醉的分膏纯化及其活性测突 分离纯化 淮意事项 目的 尽量减少酶活性的损失；低温0~5℃，有机 2 过程与方法 溶剂：-15~-20℃；抽提液加入EDTA(络合 注意事项 金属)；抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化 活性测定 使酶失活)；不能过度搅拌，以免产生大量泡 沫，使酶变性；测定酶的比活力，使比活力升 高。酶易失活，不可烘干。通常先透析出去小 分子，浓缩，结晶或冷冻干燥制成干粉保存于 冰箱。如果是酶液，与等体积甘油混合，并适 当加入竞争性抑制剂-20℃长期保存
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 注意事项 尽量减少酶活性的损失；低温 0～5℃，有机 溶剂：-15～-20℃；抽提液加入EDTA（络合 金属）；抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化， 使酶失活）；不能过度搅拌，以免产生大量泡 沫，使酶变性；测定酶的比活力，使比活力升 高。酶易失活，不可烘干。通常先透析出去小 分子，浓缩，结晶或冷冻干燥制成干粉保存于 冰箱。如果是酶液，与等体积甘油混合，并适 当加入竞争性抑制剂-20℃长期保存。 分离纯化 活性测定 目的 过程与方法 注意事项 1 (1) (2) (3)
生物 化学 第之节酵的分高纯化及其活性测定 分离纯化 酶活力 2 活性测定 指酶催化化学反应的能力。其 酶活力 衡量标准是酶促反应的速度。 所以酶活力测定就是酶促反应速 (2 反应初速度 度的测定 3 测定方法 酶促反应的速度：在适宜条件 4 活力单位 实例 下，单位时间内底物的消耗或产物 的生成量
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 酶活力： 指酶催化化学反应的能力。其 衡量标准是酶促反应的速度。 所以酶活力测定就是酶促反应速 度的测定 酶促反应的速度：在适宜条件 下，单位时间内底物的消耗或产物 的生成量。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 (1) (2) (3) (4) (5)
第之节醉的少高纯化及共活性测定 分离纯化 2 活性测定 P产物浓度 撞 反应初速度V 酶活力 2 反应初速度 产物浓度变化曲线 3 测定方法 活力单位 实例 时间 等。 因此 ,以酶促反应初速度表示酶活力
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 酶促反应初速度 酶促反应速度在最初一段时间内保持 恒定，随着反应时间的延长，酶反应速 度逐渐下降。 其原因可能是： 底物浓度下降 ；酶在一定pH及温度下 失活；产物对酶的抑制，产物上升而加 速逆反应；反应体系中理化性质（pH、 离子强度）的改变，会影响酶与底物的 亲和性，以及辅助因子的可利用性等。 因此，以酶促反应初速度表示酶活力。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 [P] 0 X 时 间 T V0 产 VX 物 浓 度 产物浓度变化曲线 反应初速度Vo 1 (1) (2) (3) (4) (5)
生物 化学 第去节酵的分高纯化及其活性测定 测定方法 分离纯化 测定酶活力就是测定一定时间底物的 2 活性测定 消耗量或产物的生成量，主要根据底物 酶活力 和产物的物理化学性质来选择具体的测 2 反应初速度 定方法。通常是测定产物的生成量。 测定方法 常用的方法主要有：比色法，分光光 活力单位 度法，化学滴定法，电化学分析法，比 实例 旋光度，荧光测定，放射同位素法，气 体压测定，比浊法等
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 测定方法 测定酶活力就是测定一定时间底物的 消耗量或产物的生成量，主要根据底物 和产物的物理化学性质来选择具体的测 定方法。通常是测定产物的生成量。 常用的方法主要有：比色法，分光光 度法，化学滴定法，电化学分析法，比 旋光度，荧光测定，放射同位素法，气 体压测定，比浊法等。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 (1) (2) (3) (4) (5)
第之节醉的分膏纯化及其活性测定 活力单位 1976年国际生化学会(IUB)酶学委员会规定： 分离纯化 在特定的条件下（温度为25℃，其他条件为最 活性测定 适)，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶 酶活力 量为一个国际单位(IU)。 (2 反应初速度 1979年规定： 在特定的条件下，每钞钟使1mol底物转化为产物 3 测定方法 所需的酶量为1催量(kat)。 活力单位 1IU=16.67×109kat 实例 单位质量酶产品中酶活力称比活力。 umg酶蛋白 u/ml酶蛋白
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 活力单位 1976年国际生化学会（IUB）酶学委员会规定： 在特定的条件下（温度为25℃，其他条件为最 适），每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶 量为一个国际单位（IU）。 1979年规定： 在特定的条件下，每钞钟使1mol底物转化为产物 所需的酶量为1催量（kat）。 1 IU=16.67×10-9kat 单位质量酶产品中酶活力称比活力。 u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 (1) (2) (3) (4) (5)
生物 化学 第六节醉的分膏纯化及其活性测定 实例 脂肪 脂肪酶 甘油+脂肪酸 分离纯化 首先确定反应条件20℃、pH=7,底物浓度 6g1(过量)，加入2mg固体脂肪酶 2 活性测定 第二确定活力单位如每小时催化1克底物 酶活力 lu=1g/h (2 反应初速度 第三测算反应初速度作产物甘油随时间增加 3 测定方法 的曲线，量出反应初速度值，换算为脂肪的消 4 活力单位 耗速度如8g/h 实例 第四换算活力 8g/h 1g/h=8u 第五计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白
生物 化学 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 实例 首先 确定反应条件 20℃、pH=7，底物浓度 6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶 第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h 第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加 的曲线，量出反应初速度值，换算为脂肪的消 耗速度 如 8g/h 第四 换算活力 8g/h / 1g/h=8u 第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 脂肪 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 1 (1) (2) (3) (4) (5)