生物大分子波谱学原理 吴季辉 7.3主链三共振序列指认 三维，四维三共振实验对于大蛋 白质的核磁研究具有特别的意义， 因为这些实验提供了蛋白质主链以 及部分侧链原子的明确无误的谱峰 证认手段
7.3主链三共振序列指认 生物大分子波谱学原理 吴季辉 三维，四维三共振实验对于大蛋 白质的核磁研究具有特别的意义， 因为这些实验提供了蛋白质主链以 及部分侧链原子的明确无误的谱峰 证认手段
生物大分子波谐学原理 吴季辉 7.4三共振谱 多肽链的结构特点： 个氨基酸残基的H自旋由一个或多个自旋体系组 成，而同核谱中一个自旋体系必定属于同一个残基 同一个残基及相邻残基的H之间距离可能比较近， 但由于蛋白质空间折叠的缘故，蛋白质一级序列上 相隔甚远的残基的H也可能距离比较近 H-C-H H-C-H H H
7.4 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉 多肽链的结构特点： 一个氨基酸残基的1H自旋由一个或多个自旋体系组 成，而同核谱中一个自旋体系必定属于同一个残基 同一个残基及相邻残基的1H之间距离可能比较近， 但由于蛋白质空间折叠的缘故，蛋白质一级序列上 相隔甚远的残基的1H也可能距离比较近
生物大分子波谱学原理 吴季辉 7.4三共振谱 同核H谱提供的信息： COSY 提供同碳偶合(geminal coupling)及邻 位偶合(vicinal coupling)的H信息 TOCSY 提供同一自旋体系的H信息 因此COSY类型实验及TOCSY只能给出同 残基内的H的连接信息 NOESY提供空间距离近的H信息，通常有 NOE的H处于同一残基或相邻残基，但也有一部 分（可能达10%）属于相隔一个残基以上的H之 间的NOE
7.4 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核1H谱提供的信息： COSY 提供同碳偶合(geminal coupling)及邻 位偶合(vicinal coupling)的1H信息 TOCSY 提供同一自旋体系的1H信息 因此COSY类型实验及TOCSY只能给出同 一残基内的1H的连接信息 NOESY 提供空间距离近的1H信息，通常有 NOE的1H处于同一残基或相邻残基，但也有一部 分（可能达10%）属于相隔一个残基以上的1H之 间的NOE
生物大分子波谐学原理 吴季辉 7.4三共振谱 在同核H谱基础上的谱峰证认手段： 由同核相关谱找出谱峰所属的自旋体系，判别可 能的氨基酸类型 由NOESY结合已知的蛋白质序列进一步确定氨 基酸类型并确定其在蛋白质序列上的位置 由于序列证认依靠NOESY,有错误证认的可能， 通常需要在获得初步结构的过程中反复check NOE,纠正可能的误认，因而实际上序列证认与 结构计算不可完全分开
7.4 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉 在同核1H谱基础上的谱峰证认手段： 由同核相关谱找出谱峰所属的自旋体系，判别可 能的氨基酸类型 由NOESY结合已知的蛋白质序列进一步确定氨 基酸类型并确定其在蛋白质序列上的位置 由于序列证认依靠NOESY，有错误证认的可能， 通常需要在获得初步结构的过程中反复check NOE，纠正可能的误认，因而实际上序列证认与 结构计算不可完全分开
生物大分子波谱学原理 吴季辉 7.4三共振谱 13C,15N双标记蛋白质的异核三共振谱利用单 键和两键J偶合建立主链原子和部分侧链原子间 的关联，既可提供残基内的，也可提供相邻残基 的HN,15N,1H,13Ca,13CO等原子间的关联信息， 即完成序列证认，由于主要信息来自J偶合，在 结构计算前即可完成大部分，至少主链部分的所 有原子的谱峰证认。既提高证认的可靠性，又加 快证认的速度。而且从获得的主链原子的化学位 移还可判定残基的类型以及所处的二级结构类型
7.4 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉 13C， 15N双标记蛋白质的异核三共振谱利用单 键和两键J偶合建立主链原子和部分侧链原子间 的关联，既可提供残基内的，也可提供相邻残基 的1HN , 15N,1H , 13C , 13CO等原子间的关联信息， 即完成序列证认，由于主要信息来自J偶合，在 结构计算前即可完成大部分，至少主链部分的所 有原子的谱峰证认。既提高证认的可靠性，又加 快证认的速度。而且从获得的主链原子的化学位 移还可判定残基的类型以及所处的二级结构类型
生物大分子波谐学原理 吴季辉 7.4三共振谱 三共振实验的命名方式： 在间接维或采样维标记的自旋用HN,N,HA,CA,CO,HB,CB等表示，分别代表 1HN,15N,H,13C,13CO,H,13C,不会引起误解时还可进一步简化：信号传递过程中经过并起 重要作用，但没有频率标记的自旋用类似符号，但放在括号内以示区别。 例： 一个三共振实验利用下列相千传递： H→15N(G）→C0→C(2）→C0→5N→'H(4) 按照上述可以称为(HN)N(CO)CA(CO)N)NH实验，这个实验属于”out and back'”类型， 有相当一部分三共振实验属于此类型，由于事实上这类实验激发与检测均是H核，因此可 以将回传部分略去而不会导致误解，即省略成(HNN(CO)CA,由于同N相连的H只能是 HN,所以可以简化成(H),而最后检测的正是这个H,故实际上用的名称为HN(CO)CA 当然这个名称也可用于描述下列相千传递： 1Hw→15N→13CO13C“(t)）→CO→5N(t2)→1Hw(t) 实际上这两个实验提供的信息一样，同一个实验可以有不同的实现方案。 'Ja≈91Hz'Jc≈7-11也2Jc4-9H五Jxo15,1Jo≈55Hz 'Jcm≈l40Hz((aliphatic,)'Jcg≈160H((aromatic,).'Jco≈35
7.4 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谱学原理 吴季辉 1J-and 2J-couplings in proteins 13 35H 13 13 35 Hz 35 Hz. 13 55H13 515N -1H13 55H13 7Hz 140Hz -92H <IH H
1J- and 2J-couplings in proteins 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谐学原理 吴季辉 7.3三共振谱 H-C-H H-C一H H-C-H HNCA HCACO HN(CO)CA HCA(CO)N HNCO CBCANH d- HN(CA)CO CBCA(CO)NH H(CA)NH HBHA(CBCACO)NH 0@ 0-C-0 H-C-H ①0-@ H-C-H HBHA(CBCAINH C(CONH-TOCSY HO由
7.3 三共振谱 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谱学原理 吴季辉 Relative sensitivity of triple resonance experiments Experiment Assignment Comment Relative S/N[%] HNCO H①，N①，Ci-1) 20 kD.above use 'H labeling 100 HNCA H①，Ni,Co,Cci-I) 20 kD,above use'H labeling 50/15 HN(COCA H(i),N(i),Co(i-1) 20 kD,above use 'Hlabeling 71 HN(CA)CO Hi.Ni,C(① 20 kD,above use 'H labeling 13/4 CBCA(CONH H①，N0,Cci-I,CBi-I) <20 kD,above use 'H labeling 13/9oB HBHACONH H(i),N(i),Hodi-1),Hg(i-1) 20 kD.above use'H labeling 13/90β CBCANH. H(i),N(D),Co(1),CB(i), <15 kD,above use 'H labeling 41.70βi) HNCACB Cofi-1),CB(i-1) 1.3/0.5 ov/B(i-1) (H)CC(CONH- H0,N①，Caliph(.i-l) <15-20 kD,above use 'H labeling TOCSY HCCXCONH- H①，N0.,Haph(i-l) <15-20 kD,above use 'H labeling TOCSY HCCH-TOCSY Haliph.Caliph. 25 kD,-sensitive,but tedious to analyze, combine with HCCONH type experiments
Relative sensitivity of triple resonance experiments 生物大分子波谱学原理 吴季辉
生物大分子波谐学原理 吴季辉 Relative sensitivity of triple resonance experiments Experiment Nuclei observed Evaluation Relative S/N % HNCO Hi).N(0.Ci-1) <20 kD.above use 2H labelling 100 HNCA Hi0.N(0.C.(i.C.(d-1) <20 kD.above use "H labelling 50/15 HN(CO)CA H①，Ni0.Cad-1) <20 kD.above use 2H labelling 71 HN(CA)CO H(D).N(D).C'(1) <20 kD.above use 2H labelling 13/4 CBCA(CONH H(1).N(1).Ce(i -1).Ca(i-1) <20 kD.above useH labelling 139a/B HBHA(CONH H).N(0.H(i-1).Hg(1-1) <20 kD.above use 2H labelling 139x/B CBCANH.HNCACB H0.N0.C.(i. <15 kD.above useH labelling 4/1.7aB(0 Ce(0.C.(1-1).Cg-1) 130.5ax/B(-1) (H)CC(CONH-TOCSY H0.N0.C(1-1) <15-20 kD.above use2H labelling H(CC(CONH-TOCSY H0.N0.H-t-1) <15-20 kD,above use2H labelling HCCH-TOCSY Hiph.Caliph. <25 kD.sensitive.but tedious to analyze,combine with HCCONH type experiments Aromatic side-chain <15 kD.for aromatic resonance experiments assignments CT-HNCA with 2H-decoupling H0.N(0.C.(i.C.(i-l) with 2H-labelling excellent S/N up to 64 kD has been shown NOESY-'H.I5N-HSQC H(NH().N() NOEs of amide protons NOESY.'H.BC-HMOC H(H().CU) NOEs to BC bound protons:record preferably in D2O:yields the majority of NOE derived distance restraints w2-filtered NOESY HH-(2C/4N) for unlabelled ligand:intra-and intermolecular NOEs H.C-HMQC-@-filtered HCH-C4N) unambiguous identification of NOESY intermolecular NOEs,S/N problems for complexes 25 kD
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