2017年2月 中国比较医学杂志 February, 2017 第27卷第2期 CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE Vol. 27 No. 2 综述与专论 AAⅴ载体靶向修饰策略在基因治疗中的研究进展 邓怡晨,刘云波 (中国医学科学院医学实验动物研究所,北京100021) 【摘要】腺相关病毒( adeno- associated virus,AAV)是微小病毒科的一种,它能以其广泛的宿主范围及低的免 疫原性对人及灵长类进行感染,而且经过改造后的AAVⅤ能够更有效的转导特异组织及细胞。腺相关病毒作为 种基因治疗载体其生物学特性已被深入了解,通过改造腺相关病毒的血清型和蛋白衣壳结构能够扩宽其应用范 围。本文对AAⅤ病毒载体的衣壳蛋白基因工程修饰、转录水平调控修饰、基因改造和衣壳蛋白共价偶联修饰的靶 向机理以及相关的一些研究成果进行介绍 【关键词】腺相关病毒靶向基因治疗 【中图分类号】R33【文献标识码】A【文章编号】1671-7856(2017)020081405 doi:10.3969.jisn.1671-7856.2017.02.015 Progress in targeting modification strategy of AAv vector in gene therapy DENG Yi-chen. liu Yun-bo Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences. Beijing 100021) Abstract] Adeno-associated virus( AAV) belongs to the family of Parvoviridae. It is a small virus which can infect humans and some other primate species with extensive host cell and low-immunogenicity. Besides, modified AAV can target the specific tissues and cells effectively. As a kind of gene therapy vector, Adeno-associated virus have been widely known of its biological characteristics. By modification of the adeno-associated virus serotype and structure of capsid protein can extend the application range of AAV vectors. This article introduces the targeting mechanism and results of some researches, the genetic engineering modification of AAV capsid proteins, the transcription regulation modification gene expression, and gene modification and the covalent coupling of AAV capsid proteins Key words] Adeno-associated virus(AAV): Targeting; Gene therapy 随着对腺相关病毒( adeno- associated virus,载体来转导治疗基因有宿主范围广泛及低免疫原 AAV)研究的深入,研究人员发现AAV作为转导基性等优点。而且经过AAV改造后的重组腺相关病 因的载体有一定的局限性,如AAV宿主范围广泛、毒( recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体更 组织或细胞特性缺乏等,使得其作为基因的载体被能有效的转导治疗基因和靶向特定的组织或细 用于临床治疗实验中存在安全性、靶向性和转染效胞{2,3。在AAV成功用于基因治疗的研究中,需要 率低的缺陷口。因此,AAV的靶向性对于基因治疗尽可能提高基因治疗的效率和努力使其造成的细 的成功与否非常关键。具有靶向性的病毒载体是胞毒性降到最低,探究AAⅤ载体介导基因治疗的最 目前基因治疗临床试验研究的主要载体,应用AAV佳靶向策略。目前优化AAV的感染靶向性有四种 [基金项目]国家科技支撑计划(Na.2014BAO3B01)。 [作者简介]邓恰晨(1991-),女,硕士研究生,动物学, Email: vichendengt007@126 [通讯作者]刘云波(1962-),男,研究员,Email:yunboliu@126.com
２０１７ 年 ２ 月 第 ２７ 卷 第 ２ 期 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｆｅｂｒｕａｒｙ， ２０１７ Ｖｏｌ． ２７ Ｎｏ． ２ ［基金项目］国家科技支撑计划（Ｎｏ． ２０１４ＢＡＩ０３Ｂ０１）。 ［作者简介］邓怡晨（１９９１ － ），女，硕士研究生，动物学，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｃｈｅｎｄｅｎｇ００７＠ １２６． ｃｏｍ。 ［通讯作者］刘云波（１９６２ － ），男，研究员，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｎｂｏｌｉｕ＠ １２６． ｃｏｍ。 综述与专论 ＡＡＶ 载体靶向修饰策略在基因治疗中的研究进展 邓怡晨，刘云波 （中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 １０００２１） 【摘要】 腺相关病毒（ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）是微小病毒科的一种，它能以其广泛的宿主范围及低的免 疫原性对人及灵长类进行感染，而且经过改造后的 ＡＡＶ 能够更有效的转导特异组织及细胞。 腺相关病毒作为一 种基因治疗载体其生物学特性已被深入了解，通过改造腺相关病毒的血清型和蛋白衣壳结构能够扩宽其应用范 围。 本文对 ＡＡＶ 病毒载体的衣壳蛋白基因工程修饰、转录水平调控修饰、基因改造和衣壳蛋白共价偶联修饰的靶 向机理以及相关的一些研究成果进行介绍。 【关键词】 腺相关病毒 靶向 基因治疗 【中图分类号】 Ｒ⁃３３ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】１６７１⁃７８５６（２０１７） ０２⁃００８１⁃０５ ｄｏｉ： １０ ３９６９． ｊ． ｉｓｓｎ． １６７１ － ７８５６ ２０１７ ０２ ０１５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ＤＥＮＧ Ｙｉ⁃ｃｈｅｎ， ＬＩＵ Ｙｕｎ⁃ｂｏ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２１） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ． Ｉｔ ｉｓ ａ ｓｍａｌｌ ｖｉｒｕｓ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｉｎｆｅｃｔ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｌｏｗ⁃ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＡＡＶ ｃａｎ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ，Ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｋｎｏｗｎ ｏｆ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｗｅ ｃａｎ ｅｘｔｅｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ）； Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ； Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ 随 着 对 腺 相 关 病 毒 （ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ， ＡＡＶ）研究的深入，研究人员发现 ＡＡＶ 作为转导基 因的载体有一定的局限性，如 ＡＡＶ 宿主范围广泛、 组织或细胞特性缺乏等，使得其作为基因的载体被 用于临床治疗实验中存在安全性、靶向性和转染效 率低的缺陷［１］ 。 因此，ＡＡＶ 的靶向性对于基因治疗 的成功与否非常关键。 具有靶向性的病毒载体是 目前基因治疗临床试验研究的主要载体，应用 ＡＡＶ 载体来转导治疗基因有宿主范围广泛及低免疫原 性等优点。 而且经过 ＡＡＶ 改造后的重组腺相关病 毒（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ｒＡＡＶ）载体更 能有效的转导治疗基因和靶向特定的组织或细 胞［２， ３］ 。 在 ＡＡＶ 成功用于基因治疗的研究中，需要 尽可能提高基因治疗的效率和努力使其造成的细 胞毒性降到最低，探究 ＡＡＶ 载体介导基因治疗的最 佳靶向策略。 目前优化 ＡＡＶ 的感染靶向性有四种
中国比较医学杂志2017年2月第27卷第2期 Chin J Comp Med, February2017,Val.27.No.2 策略:一是衣壳蛋白基因工程修饰;二是在转录水染率。 平上进行靶向调控;三是通过基因改造:四是对衣 壳蛋白通过共价偶联进行修饰。 2在转录水平上进行靶向调控 1衣壳蛋白基因工程修饰 在转录水平对AAV靶向调控方式包括:一、组 织特异性启动子调控AAV载体转导基因的靶向性 AAV对细胞的靶向性依赖于其衣壳和特异细 、转录后水平的 micrornA靶向元件调控AAV的 胞表面受体的相互作用,是由受体和衣壳的相互作靶向性。 用介导的AAⅤ内化和细胞运输等过程。目前对构2.1组织特异性启动子对AAⅴ的靶向性探究 成衣壳的cap蛋白( capsid protein)进行改造成为 在机体内,几乎所有的细胞都具有完整基因 主要研究方向4-6。 组,但在不同组织细胞中会呈现出不同的表型特 在早期对AAV靶向性研究中一般是直接将目征,这是因为由DNA中的启动子、增强子元件及转 标配体插入到cap基因中。如Yang等首次构建了录因子相互作用在基因组表达过程中调控基因的 种以人类造血干细胞为靶点的AAV载体,方法是转录。病毒启动子如CMV具有广泛的组织表达特 在AAV2的ⅤP2蛋白N端插入了抗人CD34的单链性,也就是在多种细胞中均有活性,在传统的基因 抗体基因,结果显著地增强了AAV对CD34细胞的治疗研究中,经常会选择这类病毒启动子来调控基 感染率。随后的研究中, Buning等发现在AAV2因治疗的表达,这就不可避免的对靶外细胞和组织 衣壳蛋白的表面有6位点暴露出来,位点分别是产生毒副作用,并引起机体免疫反应,2。而组织 261、381、447、534、573、587,且在这些位点插入一些特异性启动子则由于启动子对细胞的特异性而限 氨基酸序列不会影响病毒的衣壳包装等正常生活制基因只在靶细胞中才能得以表达,更加适合用于 周期并且能改变其转染趋向性。如Whie等构建了基因治疗的靶向调控 靶向人内皮细胞的AAV载体,即在AAV2衣壳的 目前,各类型的组织特异性启动子已经被报道 587位点插入靶向人内皮细胞的多肽序列,结果是并用于AAV载体靶向调控的研究中。但有些特异 大大增强了AAV2载体转染人内皮细胞的靶向性。性启动子的活性要低于病毒启动子,如在肝脏细胞 而且该突变体感染途径不依赖硫酸乙酰肝素中,α-抗胰酶(hA)、白蛋白(Alb)都是肝特异性蛋 ( heparan sulfate proteoglycan,HsPG)而增强了其特白基因,这两种启动子比CMV启动子的活性低。 异靶向性。因为野生型AV2广泛趋向性是在其感 Okuyama等在hAT启动子上插入了肝特异性增强 染各种细胞过程中先与HSPG结合,而大多细胞表子ApoE,较之前单一特异性启动子表达水平提高 面都表达葡萄糖胺聚糖8 15倍。在用AAV介导的肝靶向性血友病基因治 随后,很多研究团队也分别通过直接插入的方疗中, Jenny Mclntosh等用rAAV载体携带重组人类 式在AAV衣壳上插入选择配体从而构建了具有不凝血因子ⅤI靶向转导肝细胞实验中,选择用一种 同靶向性的AAV载体。 Grumman等用受体靶向性修肝脏细胞特异性的嵌合启动子HP,同时还优化了 饰AAV衣壳,将肿瘤靶向多肽序列 NGRAHA插入B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ基因中226个氨基酸 至AAVⅤ衣壳的特定位点,使插入该靶向多肽的区域,用新型17-a肽替换,用所构建的新型rAAV AAⅤ载体感染 Kaposi肉瘤细胞和胚胎横纹肌肉瘤载体( rAAV-HLP-codop-hFⅤIV3)通过外周静脉注 细胞的能力远高于用野生型AV2的感染效果9。射靶向感染肝细胞,得到超生理水平表达目的基因 Nicklin等通过用多肽 SIGYPLP修饰AAV衣壳,使的结果,且在小鼠和猕猴的体内都得到有效的 构建的AAV能人为靶向的感染多种肿瘤细胞株,包验证1。 括恶性黑色素瘤细胞系(C8161)、前列腺癌细胞系 对于神经系统疾病而言,由于血-脑屏障的存 (PC-3和 LnCAP)、胃癌细胞系(MKN45)、和肺腺在,用基因治疗的方法很难将外源的基因表达产物 癌细胞(A549),而且不受AAV本身对细胞亲噬性转运到脑部进而达到治疗效果。AAV是一类微小 的影响。这些研究有力的说明了野生型AAV经的,且在正常细胞中不发生产毒性感染的病毒,研 过对衣壳蛋白进行插入和突变修饰能提高其对特究表明AAV9型载体不仅可以在脑中扩散,还能够 异细胞的靶向性,从而提高AAV转导目的基因的转使目的基因进入脑部的中枢神经系统,所以AAV能
策略：一是衣壳蛋白基因工程修饰；二是在转录水 平上进行靶向调控；三是通过基因改造；四是对衣 壳蛋白通过共价偶联进行修饰。 １ 衣壳蛋白基因工程修饰 ＡＡＶ 对细胞的靶向性依赖于其衣壳和特异细 胞表面受体的相互作用，是由受体和衣壳的相互作 用介导的 ＡＡＶ 内化和细胞运输等过程。 目前对构 成衣壳的 ｃａｐ 蛋白 （ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ） 进行改造成为 主要研究方向［４ － ６］ 。 在早期对 ＡＡＶ 靶向性研究中一般是直接将目 标配体插入到 ｃａｐ 基因中。 如 Ｙａｎｇ 等首次构建了 一种以人类造血干细胞为靶点的 ＡＡＶ 载体，方法是 在 ＡＡＶ２ 的 ＶＰ２ 蛋白 Ｎ 端插入了抗人 ＣＤ３４ 的单链 抗体基因，结果显著地增强了 ＡＡＶ 对 ＣＤ３４ 细胞的 感染率［７］ 。 随后的研究中，Ｂｕｎｉｎｇ 等发现在 ＡＡＶ２ 衣壳蛋白的表面有 ６ 位点暴露出来，位点分别是 ２６１、３８１、４４７、５３４、５７３、５８７，且在这些位点插入一些 氨基酸序列不会影响 病毒的衣壳包装等正常生活 周期并且能改变其转染趋向性。 如 Ｗｈｉｔｅ 等构建了 靶向人内皮细胞的 ＡＡＶ 载体，即在 ＡＡＶ２ 衣壳的 ５８７ 位点插入靶向人内皮细胞的多肽序列，结果是 大大增强了 ＡＡＶ２ 载体转染人内皮细胞的靶向性。 而且 该 突 变 体 感 染 途 径 不 依 赖 硫 酸 乙 酰 肝 素 （ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ，ＨＳＰＧ） 而增强了其特 异靶向性。 因为野生型 ＡＡＶ２ 广泛趋向性是在其感 染各种细胞过程中先与 ＨＳＰＧ 结合，而大多细胞表 面都表达葡萄糖胺聚糖［８］ 。 随后，很多研究团队也分别通过直接插入的方 式在 ＡＡＶ 衣壳上插入选择配体从而构建了具有不 同靶向性的 ＡＡＶ 载体。 Ｇｒｉｆｍａｎ 等用受体靶向性修 饰 ＡＡＶ 衣壳，将肿瘤靶向多肽序列 ＮＧＲＡＨＡ 插入 至 ＡＡＶ 衣壳的特定位点， 使插入该靶向多肽的 ｒＡＡＶ 载体感染 Ｋａｐｏｓｉ 肉瘤细胞和胚胎横纹肌肉瘤 细胞的能力远高于用野生型 ＡＡＶ２ 的感染效果［９］ 。 Ｎｉｃｋｌｉｎ 等通过用多肽 ＳＩＧＹＰＬＰ 修饰 ＡＡＶ 衣壳，使 构建的 ＡＡＶ 能人为靶向的感染多种肿瘤细胞株，包 括恶性黑色素瘤细胞系（Ｃ８１６１）、前列腺癌细胞系 （ＰＣ⁃３ 和 ＬｎＣＡＰ）、胃癌细胞系（ＭＫＮ⁃４５）、和肺腺 癌细胞（Ａ５４９），而且不受 ＡＡＶ 本身对细胞亲噬性 的影响［１０］ 。 这些研究有力的说明了野生型 ＡＡＶ 经 过对衣壳蛋白进行插入和突变修饰能提高其对特 异细胞的靶向性，从而提高 ＡＡＶ 转导目的基因的转 染率。 ２ 在转录水平上进行靶向调控 在转录水平对 ＡＡＶ 靶向调控方式包括：一、组 织特异性启动子调控 ＡＡＶ 载体转导基因的靶向性； 二、转录后水平的 ｍｉｃｒｏＲＮＡ 靶向元件调控 ＡＡＶ 的 靶向性。 ２ １ 组织特异性启动子对 ＡＡＶ 的靶向性探究 在机体内，几乎所有的细胞都具有完整基因 组，但在不同组织细胞中会呈现出不同的表型特 征，这是因为由 ＤＮＡ 中的启动子、增强子元件及转 录因子相互作用在基因组表达过程中调控基因的 转录。 病毒启动子如 ＣＭＶ 具有广泛的组织表达特 性，也就是在多种细胞中均有活性，在传统的基因 治疗研究中，经常会选择这类病毒启动子来调控基 因治疗的表达，这就不可避免的对靶外细胞和组织 产生毒副作用，并引起机体免疫反应［１１， １２］ 。 而组织 特异性启动子则由于启动子对细胞的特异性而限 制基因只在靶细胞中才能得以表达，更加适合用于 基因治疗的靶向调控［１３］ 。 目前，各类型的组织特异性启动子已经被报道 并用于 ＡＡＶ 载体靶向调控的研究中。 但有些特异 性启动子的活性要低于病毒启动子，如在肝脏细胞 中，α⁃抗胰酶（ｈＡＡ）、白蛋白（Ａｌｂ）都是肝特异性蛋 白基因，这两种启动子比 ＣＭＶ 启动子的活性低。 Ｏｋｕｙａｍａ 等在 ｈＡＡＴ 启动子上插入了肝特异性增强 子 ＡｐｏＥ，较之前单一特异性启动子表达水平提高 １５ 倍［１４］ 。 在用 ＡＡＶ 介导的肝靶向性血友病基因治 疗中，Ｊｅｎｎｙ ＭｃＩｎｔｏｓｈ 等用 ｒＡＡＶ 载体携带重组人类 凝血因子 ＶＩＩＩ 靶向转导肝细胞实验中，选择用一种 肝脏细胞特异性的嵌合启动子 ＨＬＰ，同时还优化了 Ｂ 结构域缺失的人凝血因子Ⅷ基因中 ２２６ 个氨基酸 区域，用新型 １７⁃ａａ 肽替换，用所构建的新型 ｒＡＡＶ 载体（ｒＡＡＶ⁃ＨＬＰ⁃ｃｏｄｏｐ⁃ｈＦＶＩＩＩ⁃Ｖ３）通过外周静脉注 射靶向感染肝细胞，得到超生理水平表达目的基因 的结果， 且 在 小 鼠 和 猕 猴 的 体 内 都 得 到 有 效 的 验证［１５］ 。 对于神经系统疾病而言，由于血⁃脑屏障的存 在，用基因治疗的方法很难将外源的基因表达产物 转运到脑部进而达到治疗效果。 ＡＡＶ 是一类微小 的，且在正常细胞中不发生产毒性感染的病毒，研 究表明 ＡＡＶ９ 型载体不仅可以在脑中扩散，还能够 使目的基因进入脑部的中枢神经系统，所以 ＡＡＶ 能 ８２ 中国比较医学杂志 ２０１７ 年 ２ 月第 ２７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏｌ． ２７． Ｎｏ． ２
中国比较医学杂志2017年2月第27卷第2期 Chin J Comp Med, February2017,vl.27.No.2 够用于研究各种神经系统疾病的治疗[.n。特定 神经元的进行性变性死亡引起各种的神经退行性3基因改造 疾病,如阿尔茨海默病(AD)患者表现为皮质神经 AAV载体在靶细胞的转导过程中双链DNA 元的丢失,帕金森病(PD)患者表现为黑质多巴胺能(dDNA)不稳定严重影响了其转导效率和持久性 神经元的丢失。因此优化AAV在神经系统中的靶研究者发现AAV的DNA中一个末端反向重复序列 向性尤为重要。 ( inverted terminal repeats,mR)中的串联重复序列 Akiya Watakabe等在狨猴大脑皮层注射携带( tandem repeat sequences,TRS)缺失或突变产生的 GFP的AAV病毒载体,得知在CMV启动子调控AAⅤ病毒将以二聚体形式稳定存在,即自身互补型 下,血清型1,5,8,9的AAV的GFP都在胶质细胞腺相关病毒( ScAA)。与常规的重组腺相关病毒相 中大量表达,且表达效率没有明显的差异。而比较,其主要特点是表达效率高且快速,所以在使 AAV2表达范围较其他4中血清型AAV明显较用时能相对降低 ScAA的使用量,进而降低机体可 小。此外,狨猴脑池内注射AAV9在整个中枢能会出现的免疫反应3,2。 SCAAV载体的出现促 神经系统中的扩散较好,而小脑薄壁组织注射,其进了AAV载体在临床试验上的应用。 扩散程度相比脑池内注射有局限性,其主要扩散 至小脑皮层和小脑传出神经元。这两种注射方式 4衣壳蛋白共价偶联修饰 都会将目的基因转导至运动神经元、神经节、背根 近年来,用化学生物学方法修饰生物大分子得 神经节、背索内侧丘、脊髓小脑束。根据不同神经到了广泛的应用,有关研究表明,用活化的高分 系统疾病的病变部位分析,前一种注射方式适用子共价结合AAV衣壳蛋白氨基酸残基能对病毒进 AD、溶酶体贮积症(ISD)等疾病硏究,后一种注射行修饰,能改变其组织特异性,提高病毒载体靶 方式适合小脑的损伤、脑干中相关的神经核团损向性 伤而造成的神经系统失调,如脊髓小脑病变症。 分子的PEG化,即活化的聚乙二醇与AAV衣 在前脑谷氨酸能神经元特异性启动子(CAMKⅡ)壳蛋白的a-以及g-氨基偶联使衣壳蛋白活性发生 调控下,所有血清型AAⅤ载体都能高效的在大脑改变进而降低AAⅤ抵抗蛋白酶水解的能力,减低免 皮层神经元( cortical neurons)细胞中表达。疫原性和毒副作用,延长体内半衰期,降低血浆清 hSyn是人SYN1基因的启动子,SYN1基因表达产除率等,2。一种水溶性高分子聚合物 pHPMA对 生的 Synapsin I蛋白,是在神经元内特异表达的蛋AV进行修饰,使高分子直接与靶细胞受体反应或 白。研究发现rsyn在狨猴浦肯野细胞中的表达通过高分子链将载体上的受体包裹,从而让AAV丧 极弱,但在啮齿类动物浦肯野细胞中启动子活性失原本具有的趋向性,实现被动靶向。 较好,说明在不同物种之间,组织特异性启动子介 综上可知,用化学方法修饰病毒能较大程度地 导基因的途径也会有差异。 优化病毒载体在基因治疗中的靶向性和转染效率, 2.2 microRNA靶向元件调控AAV的靶向性 为当前解决AAⅤ载体的靶向性等问题提供了新的 mRNA是由其前体pi-RNA被 RNasell核酸思路和方法。 内切酶 Drosha和 Dicer酶酶切和催化而形成的双链 miRNA,其一条链被降解,另一条链即具有内源性的 5结语和展望 非编码单链小分子RNA。mRNA先与基因沉默复 基因治疗中,应用较早、较广泛的两类载体是 合物( RNA-induced silencing complex,RSC)结合,然腺病毒载体和逆转录载体,但至今未取得令人满意 后在RSC的指导下, mirNA在与mRNA互补的位的临床研究结果。AA作为基因转导的载体较腺 置结合,通过使mRNA降解或抑制mRNA翻译来实病毒和逆转录病毒有很多优点,如广泛的宿主细胞 现对目的基因表达的调控。用AAV作为载体携范围低免疫源性、长时间在体内表达外源基因等。 带 miRNA转染特异性细胞较用其他病毒载体如慢为了能将AAV作为基因载体用于临床的基因治疗, 病毒、逆转录病毒等明显降低了外源基因在某些非研究者不断改善AAV对宿主或靶向细胞的转导效 靶向组织和细胞中表达而产生的免疫反应和毒副率及感染的选择性。目前有四种调控AAV靶向的 反应,2。 基本方式:一是衣壳蛋白基因工程修饰;二是通过
够用于研究各种神经系统疾病的治疗［１６， １７］ 。 特定 神经元的进行性变性死亡引起各种的神经退行性 疾病，如阿尔茨海默病（ＡＤ） 患者表现为皮质神经 元的丢失，帕金森病（ＰＤ）患者表现为黑质多巴胺能 神经元的丢失。 因此优化 ＡＡＶ 在神经系统中的靶 向性尤为重要。 Ａｋｉｙａ Ｗａｔａｋａｂｅ 等在狨猴大脑皮层注射携带 ＧＦＰ 的 ＡＡＶ 病毒载体，得知在 ＣＭＶ 启动子调控 下，血清型 １，５，８，９ 的 ＡＡＶ 的 ＧＦＰ 都在胶质细胞 中大量表达，且表达效率没有明显的差异［１８］ 。 而 ＡＡＶ２ 表达范围较其他 ４ 中血清型 ＡＡＶ 明显较 小［１９］ 。 此外，狨猴脑池内注射 ＡＡＶ９ 在整个中枢 神经系统中的扩散较好，而小脑薄壁组织注射，其 扩散程度相比脑池内注射有局限性，其主要扩散 至小脑皮层和小脑传出神经元。 这两种注射方式 都会将目的基因转导至运动神经元、神经节、背根 神经节、背索内侧丘、脊髓小脑束。 根据不同神经 系统疾病的病变部位分析，前一种注射方式适用 ＡＤ、溶酶体贮积症（ＬＳＤ）等疾病研究，后一种注射 方式适合小脑的损伤、脑干中相关的神经核团损 伤而造成的神经系统失调，如脊髓小脑病变症。 在前脑谷氨酸能神经元特异性启动子（ ＣＡＭＫⅡ） 调控下，所有血清型 ＡＡＶ 载体都能高效的在大脑 皮层 神 经 元 （ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ） 细 胞 中 表 达［１６］ 。 ｈＳｙｎ 是人 ＳＹＮ１ 基因的启动子，ＳＹＮ１ 基因表达产 生的 Ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ 蛋白，是在神经元内特异表达的蛋 白。 研究发现 ｒＳｙｎＩ 在狨猴浦肯野细胞中的表达 极弱，但在啮齿类动物浦肯野细胞中启动子活性 较好，说明在不同物种之间，组织特异性启动子介 导基因的途径也会有差异。 ２ ２ ｍｉｃｒｏＲＮＡ 靶向元件调控 ＡＡＶ 的靶向性 ｍｉＲＮＡ 是由其前体 ｐｒｉ⁃ＲＮＡ 被 ＲＮａｓｅＩＩＩ 核酸 内切酶 Ｄｒｏｓｈａ 和 Ｄｉｃｅｒ 酶酶切和催化而形成的双链 ｍｉＲＮＡ，其一条链被降解，另一条链即具有内源性的 非编码单链小分子 ＲＮＡ。 ｍｉＲＮＡ 先与基因沉默复 合物（ＲＮＡ⁃ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）结合，然 后在 ＲＩＳＣ 的指导下，ｍｉＲＮＡ 在与 ｍＲＮＡ 互补的位 置结合，通过使 ｍＲＮＡ 降解或抑制 ｍＲＮＡ 翻译来实 现对目的基因表达的调控［２０］ 。 用 ＡＡＶ 作为载体携 带 ｍｉＲＮＡ 转染特异性细胞较用其他病毒载体如慢 病毒、逆转录病毒等明显降低了外源基因在某些非 靶向组织和细胞中表达而产生的免疫反应和毒副 反应［２１， ２２］ 。 ３ 基因改造 ＡＡＶ 载体在靶细胞的转导过程中双链 ＤＮＡ （ｄｓＤＮＡ）不稳定严重影响了其转导效率和持久性， 研究者发现 ＡＡＶ 的 ＤＮＡ 中一个末端反向重复序列 （ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ，ＩＴＲ） 中的串联重复序列 （ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＴＲＳ） 缺失或突变产生的 ＡＡＶ 病毒将以二聚体形式稳定存在，即自身互补型 腺相关病毒（ｓｃＡＡＶ）。 与常规的重组腺相关病毒相 比较，其主要特点是表达效率高且快速，所以在使 用时能相对降低 ｓｃＡＡＶ 的使用量，进而降低机体可 能会出现的免疫反应［２３， ２４］ 。 ｓｃＡＡＶ 载体的出现促 进了 ＡＡＶ 载体在临床试验上的应用。 ４ 衣壳蛋白共价偶联修饰 近年来，用化学生物学方法修饰生物大分子得 到了广泛的应用［２５］ ，有关研究表明，用活化的高分 子共价结合 ＡＡＶ 衣壳蛋白氨基酸残基能对病毒进 行修饰， 能改变其组织特异性， 提高病毒载体靶 向性。 分子的 ＰＥＧ 化，即活化的聚乙二醇与 ＡＡＶ 衣 壳蛋白的 α⁃以及 ε⁃氨基偶联使衣壳蛋白活性发生 改变进而降低 ＡＡＶ 抵抗蛋白酶水解的能力，减低免 疫原性和毒副作用，延长体内半衰期，降低血浆清 除率等［２６， ２７］ 。 一种水溶性高分子聚合物 ｐＨＰＭＡ 对 ＡＡＶ 进行修饰，使高分子直接与靶细胞受体反应或 通过高分子链将载体上的受体包裹，从而让 ＡＡＶ 丧 失原本具有的趋向性，实现被动靶向［２８］ 。 综上可知，用化学方法修饰病毒能较大程度地 优化病毒载体在基因治疗中的靶向性和转染效率， 为当前解决 ＡＡＶ 载体的靶向性等问题提供了新的 思路和方法。 ５ 结语和展望 基因治疗中，应用较早、较广泛的两类载体是 腺病毒载体和逆转录载体，但至今未取得令人满意 的临床研究结果。 ＡＡＶ 作为基因转导的载体较腺 病毒和逆转录病毒有很多优点，如广泛的宿主细胞 范围、低免疫源性、长时间在体内表达外源基因等。 为了能将 ＡＡＶ 作为基因载体用于临床的基因治疗， 研究者不断改善 ＡＡＶ 对宿主或靶向细胞的转导效 率及感染的选择性。 目前有四种调控 ＡＡＶ 靶向的 基本方式：一是衣壳蛋白基因工程修饰；二是通过 中国比较医学杂志 ２０１７ 年 ２ 月第 ２７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏｌ． ２７． Ｎｏ． ２ ８３
中国比较医学杂志2017年2月第27卷第2期 Chin J Comp Med, February2017,Val.27.No.2 转录水平进行调控;三是通过基因改造;四是衣壳 326-330 蛋白共价偶联修饰。为了将AV载体作为基因治[] Rashnoneja, hermahini GA,ls, et al. Large-sca 疗的工具,需要研究更多的AAV亚型、在基因水平 production of adeno-associated viral vector serotype -9 carrying the human survival motor neuron gene [J]. Mol Biotechnol, 2015 上将AAV感染靶向性和转录靶向性相结合,更加深 58(1):1-7 入的了解AAV在机体内的各种分子机制。 [12] Yang Q, Mamounas M, Yu G, et al. Development of novel cell 除了从以上这些基因分子水平上调控AAV的 surface CD34-targeted recombinant adenoassociated virus vectors 靶向性的策略,注射途径的选择及添加辅助药物、 for gene therapy [J]. Hum Gene Ther, 1998, 9(13):1929 不同物种的差异和病毒的多重感染都会影响到 AAV对组织和细胞转导的靶向性、感染率。为了解 [13 Meng X, Feng Y, Ouyang T, et al. Specific gene expression in mouse cortical astrocytes is mediated by a 1740bp-GFAR 决这些问题,当前有许多研究正致力发展其他策 promoter-driven combined adeno-associated virus 2/5/7/8/9 略,如构建新型靶向AAV载体以降低免疫反应和提 [门]- Neurosci Lett,2015,593:45-50. 高治疗效果、在不同实验动物疾病模型探究AAV转[14] Mclean Jh, Smith ga, Rocha em, et al. wide- pread neuron 导机制的异同等。相信随着对靶向修饰AAV的技 specific transgene expression in brain and spinal cord following 术越来越成熟,会有力的促进人类疾病基因治疗的 synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection [J]. Neurosci Lett, 2014, 576: 73-78 发展。 [15 Matsuzaki Y, Konno A, Mukai R, et al. Transduction profile of 参考文献 the marmoset central nervous system using adeno-associated virus serotype vectors [J]. Mol Neurobiol, 2016, Feb 16. Epub 1]赵丽琴,席斌,彭华松.腺相关病毒(AAV)载体研究进展 ahead of print]Dol10.1007/512035-016-9777-6 [J].生物技术进展,2012,02(2):110-115 [16] Liu Q, Perez CF, Wang Y. Eficient site-specific integration of 2]王毅刚,黄芳,蔡荣,等.腺相关病毒载体的靶向策略探讨 large transgenes by an enhanced herpes simplex virus/ adeno- [冂].科学通报,2007,52(10):1107-1115 associated virus hybrid amplicon vector [J] J Virol, 2006 [3]何茂锐,黄爱龙.感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治 疗中的研究进展[J国际病毒学杂志,200,12(5):136[17]LeK, Maheshri N, Kaspar B,tal. PEG conjugation moderately protects adeno-associated viral vectors against antibody [4]Watakabe A, Ohtsuka M, Kinoshita M, et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes I,2,5,8 and [18] Kohli M, Rago C, Lengauer C, et al. Facile methods for and macaque cerebral cortex [JJ generating human somatic cell gene knockouts using recombinant Neurosci Res,2015,93:144-157. adeno-associated viruses [5]王启钊,吕颖慧,李招发,等.腺相关病毒的衣壳装配和 (1):e3 DNA衣壳化机制[].生物工程学报,2011,27(4):53119] Kelly EJ, Russell SJ. MicroRNAs and the regulation of vector 门]. Mol Ther,2009,17(3):409-416 6] Van Vliet KM, Blouin V, Brument N, et al. The role of the [20] Kelemen RE, Mukherjee R, Cao X, et al. A precise chemical adeno-associated virus capsid in gene transfer [J]. Methods Mol strategy to alter the receptor specificity of the adeno-associated 2008,437:51-91 virus [J]. Angewandte Chemie, 2016, 55(36):10645 [7] Okuyama T, Huber RM, Bowling W, et al. Liver-directed gene 10649 therapy: a retroviral vector with a complete LTR and the ApoE [21] Melntosh J, Lenting PJ, Rosales C, et al. Therapeutic levels of antitrypsin promoter dramatically increases FVlll following a single peripheral vein administration of rAA\ expression of human a I -antitrypsin in vivo [J].Human Gene vector encoding a novel human factor VIll variant [J].Blood Ther,1996,7(5):637-645 013,121(17):3335-3344 8] Strobel B, Klauser B, Hartig JS, et al. Riboswitch-mediated [22] Hutson TH, Verhaagen J, Moon LDF. Corticospinal tract attenuation of transgene cytotoxicity adeno-associated virus vector yields in HEK-293 Cells [J]. Mol Ther, 2015, 23 serotypes and a non-integrating lentiviral (10):1582-1591 the CST using viral vectors [J]. Gene Ther, 2012, 19(1): 49 [9] Rosas LE, Grieves JL, Zaraspe K, et al. Patterns of scAAV vector insertion associated with oncogenic events in a mouse [23] Guo P, Xiao X, Elgohary Y, et al. A simplified purification model for genotoxicity [J]. Mol Ther, J 2012, 20(11): 2098 method for AAV variant by polyethylene glycol aqueous two-phase J]. Bioengineered,2012,4(2):103-106. [10] Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design [24] Carlisle RC, Reuben B, Briggs SS, et al. Coating of adeno- for RNA interference [J]. Nature Biotechnol, 2004, 22(3) associated virus with reactive polymers can ablate virus tropism
转录水平进行调控；三是通过基因改造；四是衣壳 蛋白共价偶联修饰。 为了将 ＡＡＶ 载体作为基因治 疗的工具，需要研究更多的 ＡＡＶ 亚型、在基因水平 上将 ＡＡＶ 感染靶向性和转录靶向性相结合，更加深 入的了解 ＡＡＶ 在机体内的各种分子机制。 除了从以上这些基因分子水平上调控 ＡＡＶ 的 靶向性的策略，注射途径的选择及添加辅助药物、 不同物种的差异和病毒的多重感染都会影响到 ＡＡＶ 对组织和细胞转导的靶向性、感染率。 为了解 决这些问题，当前有许多研究正致力发展其他策 略，如构建新型靶向 ＡＡＶ 载体以降低免疫反应和提 高治疗效果、在不同实验动物疾病模型探究 ＡＡＶ 转 导机制的异同等。 相信随着对靶向修饰 ＡＡＶ 的技 术越来越成熟，会有力的促进人类疾病基因治疗的 发展。 参考文献： ［ １ ］ 赵丽琴， 席斌， 彭华松． 腺相关病毒（ＡＡＶ） 载体研究进展 ［Ｊ］． 生物技术进展， ２０１２， ０２（２）： １１０ － １１５． ［ ２ ］ 王毅刚， 黄芳， 蔡荣， 等． 腺相关病毒载体的靶向策略探讨 ［Ｊ］． 科学通报， ２００７， ５２（１０）： １１０７ － １１１５． ［ ３ ］ 何茂锐， 黄爱龙． 感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治 疗中的研究进展 ［Ｊ］． 国际病毒学杂志， ２００５， １２（５）： １３６ － １４０． ［ ４ ］ Ｗａｔａｋａｂｅ Ａ， Ｏｈｔｓｕｋａ Ｍ， Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １， ２， ５， ８ ａｎｄ ９ ｉｎ ｍａｒｍｏｓｅｔ， ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｍａｃａｑｕｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ［ Ｊ ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ， ２０１５， ９３： １４４ － １５７． ［ ５ ］ 王启钊， 吕颖慧， 李招发， 等． 腺相关病毒的衣壳装配和 ＤＮＡ 衣壳化机制 ［ Ｊ］． 生物工程学报， ２０１１， ２７ （４ ）： ５３１ － ５３８． ［ ６ ］ Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ＫＭ， Ｂｌｏｕｉｎ Ｖ， Ｂｒｕｍｅｎｔ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８， ４３７： ５１ － ９１． ［ ７ ］ Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ， Ｈｕｂｅｒ ＲＭ， Ｂｏｗｌｉｎｇ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｌｉｖｅｒ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＬＴＲ ａｎｄ ｔｈｅ ＡｐｏＥ ｅｎｈａｎｃｅｒ⁃α １⁃ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ α １ ⁃ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ［ Ｊ］． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， １９９６， ７（５）： ６３７ － ６４５． ［ ８ ］ Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｂ， Ｋｌａｕｓｅｒ Ｂ， Ｈａｒｔｉｇ ＪＳ， ｅｔ ａｌ． Ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｙｉｅｌｄｓ ｉｎ ＨＥＫ⁃２９３ Ｃｅｌｌｓ ［ Ｊ］． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２０１５， ２３ （１０）： １５８２ － １５９１． ［ ９ ］ Ｒｏｓａｓ ＬＥ， Ｇｒｉｅｖｅｓ ＪＬ， Ｚａｒａｓｐｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｃＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， Ｊ ２０１２， ２０（１１）： ２０９８ － ２１１０． ［１０］ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ａ， Ｌｅａｋｅ Ｄ， Ｂｏｅｓｅ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ［ Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００４， ２２ （３ ）： ３２６ － ３３０． ［１１］ Ｒａｓｈｎｏｎｅｊａｄ Ａ， Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ ＧＡ， Ｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ⁃９ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｇｅｎｅ ［ Ｊ］． Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１５， ５８（１）： １ － ７． ［１２］ Ｙａｎｇ Ｑ， Ｍａｍｏｕｎａｓ Ｍ， Ｙｕ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ＣＤ３４⁃ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ［ Ｊ］． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， １９９８， ９ （ １３ ）： １９２９ － １９３７． ［１３］ Ｍｅｎｇ Ｘ， Ｆｅｎｇ Ｙ， Ｏｕｙａｎｇ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ １７４０ｂｐ⁃ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ⁃ｄｒｉｖｅｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ／ ５ ／ ７ ／ ８ ／ ９ ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ， ２０１５， ５９３： ４５ － ５０． ［１４］ Ｍｃｌｅａｎ ＪＲ， Ｓｍｉｔｈ ＧＡ， Ｒｏｃｈａ ＥＭ， ｅｔ ａｌ． Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｎｅｕｒｏｎ⁃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｙｎａｐｓｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ⁃ｄｒｉｖｅｎ ＡＡＶ９ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ， ２０１４， ５７６： ７３ － ７８． ［１５］ Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｙ， Ｋｏｎｎｏ Ａ， Ｍｕｋａｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｍｏｓｅｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｖｅｃｔｏｒｓ ［ Ｊ］． Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ， ２０１６， Ｆｅｂ １６． ［ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ ＤＯＩ １０ １００７ ／ ｓ１２０３５ － ０１６ － ９７７７ － ６ ［１６］ Ｌｉｕ Ｑ， Ｐｅｒｅｚ ＣＦ， Ｗａｎｇ Ｙ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｂｙ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ／ ａｄｅｎｏ⁃ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ［ Ｊ］． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２００６， ８０ （４）： １６７２ － １６７９． ［１７］ Ｌｅｅ ＧＫ， Ｍａｈｅｓｈｒｉ Ｎ， Ｋａｓｐａｒ Ｂ， ｅｔ ａｌ． ＰＥＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００５， ９２（１）： ２４ － ３４． ［１８］ Ｋｏｈｌｉ Ｍ， Ｒａｇｏ Ｃ， Ｌｅｎｇａｕｅｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｆａｃｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ［ Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００４， ３２ （１）： ｅ３． ［１９］ Ｋｅｌｌｙ ＥＪ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ． ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒｏｐｉｓｍ ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００９， １７（３）： ４０９ － ４１６． ［２０］ Ｋｅｌｅｍｅｎ ＲＥ， Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ， Ｃａｏ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ａｌｔｅｒ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ［ Ｊ ］． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， ２０１６， ５５ （ ３６ ）： １０６４５ － １０６４９． ［２１］ ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ， Ｌｅｎｔｉｎｇ ＰＪ， Ｒｏｓａｌｅｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ［ Ｊ］． Ｂｌｏｏｄ， ２０１３， １２１（１７）： ３３３５ － ３３４４． ［２２］ Ｈｕｔｓｏｎ ＴＨ， Ｖｅｒｈａａｇｅｎ Ｊ， Ｍｏｏｎ ＬＤＦ． Ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ： ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ａ ｎｏｎ⁃ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ： Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＳＴ ｕｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２０１２， １９（１）： ４９ － ６０． ［２３］ Ｇｕｏ Ｐ， Ｘｉａｏ Ｘ， Ｅｌｇｏｈａｒｙ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ［Ｊ］． Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ， ２０１２， ４（２）： １０３ － １０６． ［２４］ Ｃａｒｌｉｓｌｅ ＲＣ， Ｒｅｕｂｅｎ Ｂ， Ｂｒｉｇｇｓ ＳＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏａｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ⁃ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃａｎ ａｂｌａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｔｒｏｐｉｓｍ， ８４ 中国比较医学杂志 ２０１７ 年 ２ 月第 ２７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏｌ． ２７． Ｎｏ． ２
中国比较医学杂志2017年2月第27卷第2期 Chin J Comp Med, February2017,vl.27.No.2 enable retargeting and provide resistance to neutralising antisera [27] Buening H. Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer ]. J Gene Med,2008,10(10):400-411 irected to human vascular endothelial cells [J].Mol Ther [25] Buining H, Ried MU, Perabo L, et al. Receptor targeting of 2001,4(3):174-181 adeno-associated virus vectors [J]. Gene Ther, 2003, 10(14): [28 Aydemir F, Salganik M, Resztak J, et al. Mutants at the 2-fold 1142-1151. interface of adeno-associated virus type 2( aav2)structural [26] Buie LKK, Rasmussen CA, Porterfield EC, et al proteins suggest a role in viral transcription for AAV eapsids complementary AAV virus scAAV safe and long-term J Virol,2016,90(16):7196-7204 transfer in the trabecular meshwork of living rats and monkeys [J- Invest Ophthalmol Visual Sci, 2010, 51(1): 236-248 〔修回日期〕2016-11-15 (上接第69页) 2]岳秉飞.北京实验动物质量监督检测概况[R].广州:中国 菌感染情况[].扬州大学学报(农业与生命科学版),2012 食品药品检定研究院,2015 33(2):6-9 [3]魏晓锋.上海地区实验动物质量检测现状[R].广州:上海〔9]高正琴,张强,贺争鸣,等.肝螺杆菌多重PCR检测方法的 市实验动物质量监督检验站,2015. 建立及应用[J].中国人兽共患病学报,2008,24(10):891 [4]隋丽华,范薇,杨敬,等.实验动物微生物、寄生虫抽样调查 及分析[J.实验动物与比较医学,2008,28(4):259-262.[10]袁文,张钰,刘忠华,等.广东省实验小鼠自然感染鼠诺如病 5]佟巍,张丽芳,向志光.北京地区2011~2012年度实验小鼠 毒的调查[J].中国比较医学杂志,2010,20(2):78-82. POLY病毒感染情况调查与分析[J]。中国比较医学杂志,[I1]刘芹,魏晓锋,田立立,等.上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测 分析及病毒分离[J].中国实验动物学报,2014,22(2):80 [6]Chichlowski M, Hale LP. Eects of Helicobacter infection on research: the case for eradication of helicobacter from rodent[12]田胜男.小鼠诺如病毒检测方法的研究[D].北京:北京协 research colonies [J]. Comp Med. 2009, 59(1): 10-17 和医学院,2014 [7]Hsu CC, Wobus CE, Steffen EK, et al. Development of a [13] KR Pritchett-Corming, J Cosentino, CB Clifford. Contemporary microsphere-based serologic multiplexed fluorescent immunoassay prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats [J] and a reverse transcriptase PCR assay to detect murine norovirus 1 ab animals,2009,43:165-173 infection in mice [J]. Clin Diagn Lab Immunol. 2005, 12(10): 1145-1151 修回日期〕2016-07-20 8]丁聪,冯洁,谢建云,等.应用PCR方法调查实验大小鼠螺杆
ｅｎａｂｌｅ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｒａ ［Ｊ］． Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ， ２００８， １０（１０）： ４００ － ４１１． ［２５］ Ｂüｎｉｎｇ Ｈ， Ｒｉｅｄ ＭＵ， Ｐｅｒａｂｏ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００３， １０（１４）： １１４２ － １１５１． ［２６］ Ｂｕｉｅ ＬＫＫ， Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ＣＡ， Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ ＥＣ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｆ⁃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ ｖｉｒｕｓ （ ｓｃＡＡＶ） ｓａｆｅ ａｎｄ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｏｎｋｅｙｓ ［Ｊ］． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ， ２０１０， ５１（１）： ２３６ － ２４８． ［２７］ Ｂｕｅｎｉｎｇ Ｈ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＡＡＶ２⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ［ Ｊ］． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００１， ４（３）： １７４ － １８１． ［２８］ Ａｙｄｅｍｉｒ Ｆ， Ｓａｌｇａｎｉｋ Ｍ， Ｒｅｓｚｔａｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ２⁃ｆｏｌｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ （ ａａｖ２ ） ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄｓ ［Ｊ］． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２０１６， ９０（１６）： ７１９６ － ７２０４． 〔修回日期〕２０１６ － １１ － １５ （上接第 ６９ 页） ［ ２ ］ 岳秉飞． 北京实验动物质量监督检测概况 ［Ｒ］． 广州：中国 食品药品检定研究院，２０１５． ［ ３ ］ 魏晓锋． 上海地区实验动物质量检测现状 ［Ｒ］． 广州：上海 市实验动物质量监督检验站，２０１５． ［ ４ ］ 隋丽华， 范薇， 杨敬，等． 实验动物微生物、寄生虫抽样调查 及分析 ［Ｊ］． 实验动物与比较医学，２００８，２８（４）： ２５９ － ２６２． ［ ５ ］ 佟巍，张丽芳，向志光． 北京地区 ２０１１ ～ ２０１２ 年度实验小鼠 ＰＯＬＹ 病毒感染情况调查与分析 ［ Ｊ］． 中国比较医学杂志， ２０１３， ２３（１１２）： ４０ － ４３． ［ ６ ］ Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ， Ｈａｌｅ ＬＰ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ： ｔｈｅ ｃａｓｅ ｆｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｏｍ ｒｏｄｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ． ２００９， ５９（１）： １０ － １７． ［ ７ ］ Ｈｓｕ ＣＣ， Ｗｏｂｕｓ ＣＥ， Ｓｔｅｆｆｅｎ ＥＫ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ⁃ｂａｓｅｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｒｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５， １２（１０）： １１４５ － １１５１． ［ ８ ］ 丁聪，冯洁，谢建云，等． 应用 ＰＣＲ 方法调查实验大小鼠螺杆 菌感染情况 ［Ｊ］． 扬州大学学报（农业与生命科学版），２０１２， ３３（２）： ６ － ９． ［ ９ ］ 高正琴， 张强， 贺争鸣， 等． 肝螺杆菌多重 ＰＣＲ 检测方法的 建立及应用 ［Ｊ］． 中国人兽共患病学报， ２００８， ２４（１０）： ８９１ － ８９５． ［１０］ 袁文， 张钰， 刘忠华， 等． 广东省实验小鼠自然感染鼠诺如病 毒的调查 ［Ｊ］． 中国比较医学杂志，２０１０， ２０（２）： ７８ － ８２． ［１１］ 刘芹，魏晓锋，田立立， 等． 上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测 分析及病毒分离 ［ Ｊ］． 中国实验动物学报， ２０１４， ２２（２）： ８０ － ８５． ［１２］ 田胜男． 小鼠诺如病毒检测方法的研究 ［Ｄ］． 北京：北京协 和医学院，２０１４． ［１３］ ＫＲ Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ⁃Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｊ Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ， ＣＢ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ． Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ ［ Ｊ］． Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌｓ， ２００９， ４３： １６５ － １７３． 〔修回日期〕２０１６ － ０７ － ２０ 中国比较医学杂志 ２０１７ 年 ２ 月第 ２７ 卷第 ２ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｖｏｌ． ２７． Ｎｏ． ２ ８５