第八章高效液相色谱分析 给酒演商常大是 HARBIN LNTVERSTTY OF COMMERCE
第八章 高效液相色谱分析
第一节特点与分类 特点： 高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离分析方法。 溶剂 碳酸钙 色谘带 树 苑闲道商業大孕 HARBIN LNTVERSITY OF COMMERCE
第一节 特点与分类 一、特点： 高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离分析方法
第二节高效液相色谱法的主要类型及基本原理 液-固吸附色谱(liquid-solid adsorption chromatography) 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5~ 。 10pm的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；· 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 哈潮清月掌大是 HARBIN LNTVERSTTY OF COMMERCE
第二节 高效液相色谱法的主要类型及基本原理 一、液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾
液-液分配色谱((liquid-liquid partition chromatography) 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；. 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（正相normal phase),反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相reverse phase)'。 正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 (担体)表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 疮潮清月業大孕 HARBIN LNTVERSITY OP COMMERCE
二、液-液分配色谱（liquid-liquid partition chromatography） 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）
三、离子交换色谱 (ion-exchange chromatography) 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离 子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换 剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长： 阳离子交换：R一SO,H+M=R—SO,M+H+ 阴离子交换：R-NROH+X=R—NR4X+OH 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 给源渭商業大是 HARBIN LNTVERSTTY OF COMMERCE
三、离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离 子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换 剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+ 阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH- 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等
四、离子色谱(ion chromatography) 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授。 疮潮清月業大孕 HARBIN LNTVERSITY OP COMMERCE
四、离子色谱（ion chromatography） 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授
五，离子对色谱(ion pair chromatography) 原理： 将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子 或反离子)加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，.使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 ·六烷基三甲铵作为对离子；· 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离 子X进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X 后；在两相间分配。 给源渭商業大多 HARBIN LNIVERSTTY OF COMMERCE
五、离子对色谱（ion pair chromatography） 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子 或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离 子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X - 后；在两相间分配
六、 排阻色谱色谱 size-exclusion chromatography) 固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）： 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散 到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝 选择渗透 全渗透 胶空隙，中速通过；而大分子被 全排斥 排斥在外，出峰最快：溶剂分子 小，故在最后出峰。 洗脱体积 全部在死体积前出峰；可对相对分子质 量在100-105范围内的化合物按质量分离。 给菌頌月業大多 HARBIN LNTVERSITY OF COMMERCE
六、排阻色谱色谱 （size- exclusion chromatography） 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。小分子可以扩散 到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝 胶空隙，中速通过；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶剂分子 小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；可对相对分子质 量在100-105范围内的化合物按质量分离
七、 亲和色谱（Affinity chromatograph) 原理 利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 间隔基手臂 力，进行选择性分离。 亲和物其他组分 先在载体表面键合上一种 载 具有一般反应性能的所谓间隔 体 流动相 臂（环氧、联胺等），再连接上配 基（酶、抗原等），这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 亲和色谱法示意图 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。 宏酒演商常大是 HARBIN LNTVERSTTY OF COMMERCE
七、亲和色谱（Affinity chromatograph） 原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接上配 基(酶、抗原等)，这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱
第三节 固定相与流动相 液相色谱固定相(stationary phases of LC) 1.液-液分配及离子对分离固定相 (1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100um的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10um以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； (2)表面多孔型担体 大颗粒 小颗粒 (薄壳型微珠担体)30 40um的玻璃微球，表面附着一层 实心核 厚度为1~2um的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底： 全多孔颗粒 表面多孔颗粒 给菌演消業大 HARBIN LNTVERSITY OF COMMERCE
第三节 固定相与流动相 一、液相色谱固定相（stationary phases of LC） 1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30～ 40μm的玻璃微球，表面附着一层 厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；