细菌原生质体的融合 一、目的要求 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。 二、基本原理 原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些 微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生 质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以， 目前已为国内外微生物有种工作所广泛研究和应用。 (一）原生质体融合的优点 (1)克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解 除去细胞壁(ceI1walI),因此，即使相同接合型的真菌或不同种属 间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2)基国重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇 (PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原 生质体融合后，两个亲株的整套基因组（包括细胞核、细胞质）相互 接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种 类型的重组子。 (3)可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到 一个菌株中
(4)存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 (二)原生质体融合步骤 (1)选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株 作为亲本。 (2)制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁(ce11wa1I),释放出原生质 体，并置高渗液中维持其稳定。 (3)促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种 表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有C2+、Mg2+离 子存在时，更能促进融合。 (4)原生质体再生原生质体已失去细胞壁(ceI川waII),虽有生物活 性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。 (⑤)检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。 (6)融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不 同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛 选出生产性能良好的融合子。 (三)原生质体再生率和融合率计算 三、实验材料 (一)菌种 枯草芽孢杆菌T4412ade-his-、枯草芽孢杆菌TT2ade-pro- (二)培养基（见附录） (1)完全培养基(CM,液体)： (2)完全培养基(CM,固体)液体培养基中加入2.0%琼脂：
(3)基本培养基(MM); (4)补充基本培养基(SM)在基本培养基中加入20g/mL的腺嘌呤及 2%的纯化琼脂，75Pa灭菌20min: (⑤)再生补充基本培养基(SMR)在补充基本培养基中加入0.5mol/儿 蔗糖，1.0%纯化琼脂作上层平板，2.0%纯化琼脂作底层平板、75Pa 灭菌20min。 (6)酪蛋白培养基（测蛋白酶活性用）。 (三)缓冲液 (1)0.1mol/儿pH6.0磷酸缓冲液。 (2)高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇。 (四)原生质体稳定液(SMM) 0.5mo1/L蔗糖、20mol/LMgC1、0.02mol/L顺丁烯二酸，调pH 6.5。 (五)促融合剂 40%聚乙二醇(PEG-4000)的SMM溶液。 (六)溶菌酶液 酶粉酶活为4000u/g,用SMM溶液配制，终浓度为2mg/mL,过滤 除菌备用。 (七)器皿 培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、 显微镜、台式离心机、721比色计、细菌过滤器