微生物分类鉴定中的经典方法 生物分类的传统指标：形态学特征、生理学特征、生态学特征。 它们从不同层次（细胞的、分子的），用不同学科（化学、物理学、遗 传学、免疫学、分子生物学等)的技术方法来研究和比较不同微生物 的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资 料。在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料， 都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。 1.形态学特征 常用的形态学特征有：培养特征、细胞形态及其染色特性、特殊 的细胞结构、运动性等等。这些形态学特征可作为微生物分类和鉴定 的重要依据之一，因为：（1)易于观察和比较，尤其是真核微生物 和具有特殊形态结构的细菌：(2)许多形态学特征依赖于多基因的 表达，具有相对的稳定性。常用于原核生物分类鉴定的形态学特征。 2.生理生化特征 生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相 关，酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较 也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析 基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是 有意义的。 常用于微生物分类鉴定的生理生化特征有：营养类型、与氧的 关系、对温度的适应性、对p州的适应性、对渗透压的适应性、代谢 产物等
在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类 鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。 形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标。 二、微生物分类鉴定中的现代方法 (一)通过核酸分析鉴定微生物遗传型 特点：与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的 比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异， 因此结果更加可信。 1.DNA的威基组成(G+CmOl) DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变， 碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用G+C占全部碱基的克分 子百分数(G+CmoI%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。 1)每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴 定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更适合 于细菌的分类鉴定。 2)GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检 验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。 3)使用原则：G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定：每 一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相 似的G+0含堂，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但 具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含
量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建 立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除 出某一分类单元。G+0含量的比较主要用于分类鉴定中的否定。 2.核酸的分子杂交法(Hybridization of nucleic acids) 生物的遗传信息以碱基排列顺序（遗传密码）形成线性地排列在 DNA分子中，不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之 间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就 越近，反之亦然。由于目前尚难以普遍地直接分析比较DNA的碱基排 列顺序，所以，分类学上目前主要采用较为间接的比较方法一核酸分 子杂交(hybr idization),来比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相 似性进行微生物的分类。核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包 括：DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交以及根据核酸杂交特异性原理制备 核酸探针。 (1)DNA-DNA杂交 DNA-DAN杂交的基本原理：对双链结构的DNA分子进行加热处 理时，互补结合的双链可以离解成单链，即DA变性：若将变性了的 DNA分子进行冷却处理时，已离解的单链又可以重新结合成原来的双 链DNA分子，这一过程叫DNA的复性。不仅同一菌株的DNA单链可以 复性结合成双链，自不同菌株的DNA单链，只要二者具有同源互补的 碱基序列，它们也会在同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为 DNA-DNA分子杂交。 自60年代将DNA-DAN杂交技术应用于细菌分类以来，已经对大
量的微生物菌株进行过研究，它对于许多有争议的种的界定和建立 新种起了重要作用。许多资料表明：DNA-DNA杂交同源性在6O%以上 的菌株可以认为是同一个种：同源性超过70%为同一亚种：同源性在 20~60%是同属不同种的关系。 (2)DNA-rRNA杂交 研究表明：当两个菌株DNA的非配对碱基超过10~20%时， DNA-DNA杂交往往不能形成双链，因而限制了DNA-DNA杂交主要应 用于种水平上的分类。为了进一步比较亲缘关系更远的菌株之间的关 系，需要用rRNA与DNA进行杂交。正如前面介绍过的，rRNA是DNA 转录的产物，在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得 多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两 个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂交仍可 能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间 的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。DNA-DNA杂交和 DNA-rRNA杂交的原理和方法基本相同，只是在技术细节上有些差异， 如DNA-rRNA杂交中，用同位素标记的是rRNA而不是DNA等等。 (3)核酸探针 通过核酸杂交来检测特定核苷酸序列的核酸探针技术，是近10 多年才发展起来的，现在已越来越广泛地用于微生物鉴定、传染病诊 断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域（为 克隆的筛选、基因表达检测等)。所谓核酸探针(probe)是指能识别特 异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子。换句话说，它
是能与被检测的特定核苷酸序列（靶序列）互补结合，而不与其他序列 结合的带标记的单链核苷酸片断。国此，一种核苷酸片断能否作为探 针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的 微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。因此，根据特异 性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某 一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的 微生物的检测或鉴定。例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonor rhoeae)隐蔽性质粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用 来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。 3.电子计算机在微生物学中的应用 随着计算机技术的飞速发展，尤其是计算机高级语言的发展和 微型机的普及，使计算机在微生物分类和鉴定中得到广泛的应用。计 算机应用于微生物分类始于数值分类法(numer ical taxonomy)。所谓 数值分类法，是通过广泛比较分类单位的性状特征，然后计算它们之 间的相似性，再根据相似性的数值划分类群的一种分类方法。数值分 类法的思想最初是由法国植物学家阿德逊(Adanson),于1757年提出 来的，由于缺少有效的计算工具而未能实现。直到1957年英国生物 学家施尼斯(Sneath)首先借助于电子计算机进行细菌的数值分分类， 这种方法才开始用于生物分类。数值分类法的分类原则不同于传统的 分类法，其中最重要的区别在于：传统分类法的分类特征有主次之分 而数值分类法则强调所采用的分类特征同等重要，在划分类群时它们 都具有同等的地位。数值分类可大致分为五个步骤：
①确定分类单位和选择分类特征。数值分类最低等级的分类单 位称操作分类单位（简称0TU),0TU可以是菌株，也可以是种或属等。 0U确定后即选择分类特征，数值分类要求特征函盖面广、项目数不 少于数十项乃至一百多项： ②进行特征测定或从文献中收集有关0TU的各项特征的资料： ③根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标准 化并输入计算机： ④由计算机计算各0TU之间的相似性并根据相似性的数值进行 聚类分析、分群归类： ⑤输出分类结果。 数值分类的结果可用多种方法表示，其中树状谱图法由于直观 明确而最为常用。数值分类法是根据生物表型特征总的相似性分类， 所以其分类结构所表示的是一种表型关系，并不直接表示生物的系统 发育，因此数值分类所划分的类群又称为表元(phenon)或表观群 (phemotic group)以区别于传统的分类单元。但通过对数值分类结 构的分析，可以把其分类结果作为建立或修改传统（自然）分类单元 (如种、属等)的依据。数值分类使生物分类从传统分类的定性描述发 展到进行定量分析的水平，其主要目的是建立一种客观的聚类方法， 并实现聚类过程的自动化。 利用电子计算机鉴定微生物的方法，为数颇众，由最简单的检 索法直到复杂的多变量分析技术，如判别分析法、相关系数法、概率 最大近似模型法等。简单的检索法，是将传统的鉴定检索表或有关资
料，存储于计算机的存储器内，进行微生物鉴定时，将未知菌的试验 数据输入计算机，计算机自动进行检索，然后输出结果。这种方法虽 然简单易行，但远不能满足现代微生物鉴定的要求，因而多变量分 析技术，尤其是概率最大近似模型法，最常用于计算机进行运算鉴定 微生物，例如：大多数微量多项试验鉴定系统、快速自动化微生物检 测仪器，它们携带的计算机软件进行的自动分析鉴定，就是用概率最 大近似模型法进行。计算机用于微生物鉴定严格说目前应是辅助鉴 定，因为它不能代替人进行微生物特征的试验，而取得原始数据资料， 然而，它存贮、分析、处理极为错综复杂的庞大数据的能力和自动输 出鉴定结果的功能，大大提高了微生物鉴定工作的效率，莫定了微生 物鉴定的快速、准确、自动化的基础