土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种 分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO、NaCI、K,HPO3H,0、MgS0·7H0、FeS0·7H,0 琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量简、玻璃棒、 三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、 酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链雾 菌)，其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性 好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的 混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群 体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒
平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基 或有机氨培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理(120℃热 处理1h),或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌， 霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使 放线茵在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色萄 萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用 化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳 源为可溶性淀粉、氨源为KNO、NaCl、KHPO~3H,0、MgS04·7H0作 为无机盐，F$07H,0作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HP04·3H200.125g,可溶性淀粉5g,硝酸钾0.25，MgS04· 7H200.125g,FeS047H200.025g,氣化钠0.125g,琼脂5g,水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌 水至250ml,调节pH=7.4,再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌
2.土壤中放线菌的分离 1.编号，分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀 释液的稀释度(10310、10)。每个稀释度做两个培养皿。然后在 每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基1520ml左 右，待冷凝成平板。 另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上， 依次标明10、102、103、104、10、10。 2.稀释倾注分离 称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min,即10'的土壤悬 液，静置30s。 用无菌吸管无菌操作取10'浓度的土壤悬液1ml并加入编号10 的无菌试管中，并吹吸吸管23次，吸时伸入管底，吹时离开水面， 使其混合均匀。即为102浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至 105的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管)。 如图 07 10310105 105 10 108 10 每管各$如l无菌水
3.倒平板分离培养 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃ 左右的高氏培养基约10一15ml,置水平位置，迅速旋动混匀，待凝 固。（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。) 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10、10、106的稀释菌液 1l,对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用 无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。 稀释涂布平板法 4培养接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天， 观察平皿上放线菌（主要是链霉菌)菌落。 菌种纯化 1、倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。 2、平板划线 划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将
样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二 种： 图V-3划线分离示意图 (门)分区划线用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状 态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁 刮取少许菌苔，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6~7条， 转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分 作第2次平行划线（图V-3),然后再用同样方法，作第3次平行划线。 划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培 养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温 室培养。 (2)连续划线将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线 (图V-4,B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置28C培养
开始处 V一4划线分离示意图 拮抗实验 长出菌落后，要判断是否已分离到了纯菌种。 1配置鉴别培养基配置金黄色萄萄球菌和大肠杆菌培养基。 2标号在两平板上标注均匀间隔的7个区域。 2桃菌落在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落依次放入 标注区域中（在火焰旁切取），置于28℃恒温箱培养1天后可观察到 有抑菌圈生成
⊙ ⊙9 ⑨ 讨论 1高氏培养基的配置关键是p州值的调节和重铬酸钾的加入。放 线菌的最适生长条件是2337，p7.07.5,而在同样条件下也利于 霉菌生长。在高温杀菌下，放线菌和霉菌的孢子仍可以存活，所以必 须加入重铬酸钾抑制雾菌和细菌的生长（对放线菌无抑制作用）。否 则霉菌大堂生长。如图 培养基配置时各成分的溶解顺序应是先加缓冲化合物，后是主要 元素、次要元素。调节p州值时，加入酸碱要缓慢、少量、多加搅拌， 防止局部过酸或过碱而破坏营养成分。 我们第一次配置的高氏培养基很可能就是由于酸碱调节时酸碱过
量和未加入重铬酸钾而导致失败。 2放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落 般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、千燥、多皱， 地衣状。表面干燥。可作为鉴别菌种的基本参考依据。 孢子丝生长到一定阶段可形成孢子由于孢子含有不同色素，成熟 的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是 鉴定菌种的依据之一。但孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定 的重要依据。 3整个过程要保证在无菌条件下进行，培养基及仪器可用高压蒸 汽灭菌。接种时，实验桌要用95%的酒精擦拭，且在接种时要在火 焰区的无菌范围内（空气中含有大量灰尘、细菌和霉菌孢子等造成污 染)，且打开培养基时间尽量短。 4稀释倒平板法时涂布要均匀，否则，细菌密度不均导致菌落生 长过于集中，细菌无法充分利用营养成分影响生长，且在鉴别时较难 看到明显的抑菌圈。 稀释时除了应用平板涂布外还用了划线法。涂布主要是通过稀释 溶液方法减少细菌分布密度，划线法通过多次划线逐渐被稀释，最后 可得到单独存在的菌落。 5放线菌是产生抗生素最多的菌种，其可以抑制金黄色葡萄球菌， 金黄色萄萄球菌是临床上常见的致病菌，且耐药性很普遍，可通过观 察其对金黄色葡萄球菌的抑制产生的抑菌圈辨别菌种。 放线菌的接种方法同细菌，多用密状婉蜒划线法，以获得大量菌
体细胞，观察孢子预色