药物生物技术 Pharmaceutical Biotechnology 2007.14(1):71~75 新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进展 陈执中 (复且大学药学院，上海200032 摘要微流路芯片毛细管电泳是20世纪90年代才发展起来的用作微型毛细管电泳分离的新技术。微 流路芯片毛细管电泳质谱联用技术是众多仪器联用中的发展前沿。文章综述微流路芯片的制作，微流路芯片 毛细管电泳的分离原理、装置和测定技术及微流路芯片毛细管电泳~质谱联用技术以及这类分析技术在生物技 术和生命科学领域研究中的应用讲展。 长健纷类管流片毛细首电法，民用技术：D人分断析基因突变伦到蛋白质多肽分 文献标识码：A 文章编号：1008915(2007)01-0071-05 人类蛋白质组计划的实施促进了新的分析技术在蛋 Cr&Au 白质研究中的应用。近年来，随着芯片技术的发展，新的 微流路芯片毛细管电泳和有关的联用技术及其在生物技 Glass a 术和生命科学领域中的应用更有了新的进展。 UVigh 一Mask 1微流路芯片毛细管电泳 22光 (b) Glass 微流路芯片是20世纪90年代发展起来的用作微型毛 8 网 细管电泳分离的一类新的芯片。1992年Me等山首先提 Glass 装老片称为微流路芯片 Glass 术用作小型化和集成的分离技术成为检测系统，应用其毛细 (e) 管作用及电渗流作为毛细管电泳分析，亦即在芯片上进行微 型毛细管电泳。这类微流路芯片用作毛细管电泳因此，又 Glass 称为集成毛细管电泳芯片(Integrated mi Glass por心sis chip)。这类分析技术称为微流路芯片毛 Glass 管电泳(Microfluidics chip capillary electrophoresis,chip CD)。目前，chip-CE已成为蛋白质研究的一种快速、高效、 图1玻璃或石英微流路芯片的制作步骤 微量测定的新技术。ChCE包括：微流路芯片的制作和 .2 Chip-CE的分离原理 分离原理、装置及测定技术。 Chip-CE是微型化的毛细管电泳技术，其分离原理基 11微流路芯片的制作 本上与常规的毛细管电泳相同。根据毛细管电泳理论经 微流路芯片的制作方法根据使用的基质不同而异， 过推导得到理论塔板数N与迁移时间的比 般多采用玻璃或石英基质因其表面易于行生化处理且产 N/t-/2D(V/L) 生的通道与毛细管电泳的毛细管相似.这类基质中应用 较广的是隔硅浮选法玻璃，主要的有：ot 式中：心电泳清度D扩散系数外加电压L~毛 细管总长度 及显微镜载玻片们等。石英用作基质也较合适，但石英增 点高且价格昂贵。l992年Fan和Harrison提出了在玻 上式表明：对一定的迁移时间而言，VL值越大则 理论塔板数越大，柱效越高。但由于毛细管的焦耳热效 璃或石英上制作微流路芯片其制作步避见图】。 收日期-200G-02-1g 作者简介：陈执中，1928年生.男，教授、主任药师，主要从事基因工程药物分析研究。Td:021~54189845,Emal:pof.工chcn @163.cm. 91994 2007China Academie Joumal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.enki.net
药 物 生 物 技 术 Pharmaceutical Biotechnology 2007 ,14 (1) :71～75 新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进展 陈执中 (复旦大学 药学院 ,上海 200032) 摘 要 微流路芯片毛细管电泳是 20 世纪 90 年代才发展起来的用作微型毛细管电泳分离的新技术。微 流路芯片毛细管电泳 质谱联用技术是众多仪器联用中的发展前沿。文章综述微流路芯片的制作 ,微流路芯片 毛细管电泳的分离原理、装置和测定技术及微流路芯片毛细管电泳 质谱联用技术以及这类分析技术在生物技 术和生命科学领域研究中的应用进展。 关键词 微流路芯片毛细管电泳 ;联用技术 ;DNA 分析 ;基因突变检测 ;蛋白质多肽分析 中图分类号 :R917 文献标识码 :A 文章编号 :100528915 (2007) 0120071205 人类蛋白质组计划的实施促进了新的分析技术在蛋 白质研究中的应用。近年来 ,随着芯片技术的发展 ,新的 微流路芯片毛细管电泳和有关的联用技术及其在生物技 术和生命科学领域中的应用更有了新的进展。 1 微流路芯片毛细管电泳 微流路芯片是 20 世纪 90 年代发展起来的用作微型毛 细管电泳分离的一类新的芯片。1992 年 Menz 等[1 ]首先提 出了用光刻微加工技术制作的微通道芯片 ,这种新的微组 装芯片称为微流路芯片 (Microfluidics chip) ,此平面芯片技 术用作小型化和集成的分离技术成为检测系统 ,应用其毛细 管作用及电渗流作为毛细管电泳分析 ,亦即在芯片上进行微 型毛细管电泳。这类微流路芯片用作毛细管电泳 ,因此 ,又 称为集成毛细管电泳芯片 (Integrated microfluidics capillary electrophoresis chip) 。这类分析技术称为微流路芯片毛细 管电泳 ( Microfluidics chip capillary electrophoresis , chip2 CE) 。目前 ,chip2CE 已成为蛋白质研究的一种快速、高效、 微量测定的新技术。Chip2CE 包括 :微流路芯片的制作和 分离原理、装置及测定技术。 111 微流路芯片的制作 微流路芯片的制作方法根据使用的基质不同而异 ,一 般多采用玻璃或石英基质 ,因其表面易于衍生化处理且产 生的通道与毛细管电泳的毛细管相似。这类基质中应用 较广的是硼硅浮选法玻璃 ,主要的有 : Schott [2 ,3 ] 、Pyrex [4 ] 及显微镜载玻片[5 ]等。石英用作基质也较合适 ,但石英熔 点高且价格昂贵。1992 年 Fan 和 Harrison [4 ] 提出了在玻 璃或石英上制作微流路芯片 ,其制作步骤见图 1。 图 1 玻璃或石英微流路芯片的制作步骤 112 Chip2CE 的分离原理 Chip2CE 是微型化的毛细管电泳技术 ,其分离原理基 本上与常规的毛细管电泳相同。根据毛细管电泳理论 ,经 过推导得到理论塔板数 N 与迁移时间 t 的比 : N/ t = u 2 / 2D(V/ L) 2 式中 :u2电泳淌度 D2扩散系数 V2外加电压 L2毛 细管总长度 上式表明 :对一定的迁移时间而言 , V/ L 值越大则 理论塔板数越大 ,柱效越高 。但由于毛细管的焦耳热效 17 收稿日期 :2006202219 修回日期 :2006205215 作者简介 :陈执中 ,1928 年生 ,男 ,教授、主任药师 ,主要从事基因工程药物分析研究。Tel :021 54189845 , E2mail :prof. z. z. chen @163. com
72 药物生物技术 第13卷第6期 应可以导致不均匀的温度梯度和局部的桔度变化而传 PCRD1的细线表示分离通道为45m的正常宽度，PCD 区带变形，蜂形变宽。焦耳热由毛细管横截面面积亦耳 图中细线表示分离通道为66μm,粗线表明240μm部分 毛细管内径大小所决定61。不同内径毛细管内的区带 演加申压溶液在每个通道的求端语过储液界引入。 变形如图2所示。 L.4 Chin Ce的测定技术 甚带货的 CpCE测定技术，包括进样，电泳分离、衍生化及荧为 检测或其他检测等。电泳分离时，由于微流路芯片的有效通 道通常长仅几匣米因此不需要如常规毛细管电泳邦样高 的电压（常规毛细管电泳一般为10一30kV).CmCE一船 仅需几千伏，实际工作中外加电压梯度一般为数百伏厘米 进样方式绝大部分均采用电动进样方式进样通道设计 与分离通道相垂直交叉，但为了提高进样体积，进样通道设 =0.10mn 计成与分离通道“双T”的部分重叠。Hu等即用“双T” 中=0.075m 注射器设计，装配在两个pyrex玻璃(pyex玻璃应以325nm -=0.023m 波长激发时显示荧光背)，图解见图4 小毛细管内经 图2焦耳热对溶质区带变形的影响 从图2可知缩小毛细管内径可以减小焦耳热效应。毛 细管内径小至50m焦耳热效应很小，25：m则焦耳热的 影响几近于零。Chip-CE的微流路芯片通道一般均低 50μm因而可以达到很好的效果， L.3Chi-CE的设计 1996年Hun等I提出了平面石英和玻璃芯片的集成 毛细管电泳设计。三种柱后反应和检测设计(ost column reaction and detection devices.PCRDs).具有不同的混合 图4“双T"注射器设计图解 器/反应器几何图形以提供高效分离PCRD1和PCRD 图解见图3(PCRD2与PCRD1仅微有不同)，这两种装置 Chip-CE的电泳分离有多种分离方式与常规的毛细管 用于柱后以邻苯二醛(OPA)进行衍生化反应.图中 电泳分离方式，包括：自由区带电泳(CZ四又称自由溶液毛 细管电泳(FSCE)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管等电聚 Waste &a2 焦电泳(CIEF)及胶束电动毛细管色谱(MECC)等，1基本 相同。 ChCE的检测由于载面积较小紫外检测段难以实 Sample Lbe ChannelDciecto 理一船多采用激光诱导荧光Laserinduced fluorescence PCRD I LF)测定。LF检测具有高灵敏度的特点，但检测仪器复 杂且样品需进行荧光标记，影响 /其应用。2000年 Wallenborg等报道了胶束电动毛细管色谱的分离方式 在微芯片应用样品不需标记的间接激光诱导荧光检测法。 电化学检测法也用于Chip-CE的检测。Wang等I用电化 学检测法如安培法，环伏安法、电位法等将电极直接置于 芯片毛细管出口端进行检测。2005年，Ta等报道了 一种新的微流路芯片毛细管电泳应用三电极电化学检测 Cabele 器进行检测。此外，Walker等II在Chip-CE的毛细管等 (OPA) 速电泳中应用拉曼光谱检测器进行检测 图3 PCRDI和PCRD3的设计图解 Chip-CE的商品化仪器，许多国外仪器公司已有生产 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.enki.net
应可以导致不均匀的温度梯度和局部的粘度变化而使 区带变形 ,峰形变宽 。焦耳热由毛细管横截面面积亦即 毛细管内径大小所决定[ 6 ] 。不同内径毛细管内的区带 变形如图 2 所示 。 Φ2毛细管内径 图 2 焦耳热对溶质区带变形的影响 从图 2 可知缩小毛细管内径可以减小焦耳热效应。毛 细管内径小至 50μm 焦耳热效应很小 ,25μm 则焦耳热的 影响几近于零。Chip2CE 的微流路芯片通道一般均低于 50μm ,因而可以达到很好的效果。 图 3 PCRD1 和 PCRD3 的设计图解 113 Chip2CE 的设计 1996 年 Fluri 等[7 ]提出了平面石英和玻璃芯片的集成 毛细管电泳设计。三种柱后反应和检测设计( Post column reaction and detection devices , PCRDs) ,具有不同的混合 器/ 反应器几何图形以提供高效分离。PCRD1 和 PCRD3 图解见图 3 ( PCRD2 与 PCRD1 仅微有不同) 。这两种装置 用于柱后以邻苯二醛 ( OPA) 进 行 衍 生化 反 应。图 中 PCRD1 的细线表示分离通道为 45μm 的正常宽度 ,PCRD3 图中细线表示分离通道为 66μm ,粗线表明 240μm 部分。 施加电压 ,溶液在每个通道的末端通过储液器引入。 114 Chip2CE 的测定技术 Chip2CE测定技术 ,包括进样、电泳分离、衍生化及荧光 检测或其他检测等。电泳分离时 ,由于微流路芯片的有效通 道通常长仅几厘米 ,因此 ,不需要如常规毛细管电泳那样高 的电压(常规毛细管电泳一般为 10～30 kV) ,Chip2CE 一般 仅需几千伏 ,实际工作中外加电压梯度一般为数百伏/ 厘米。 进样方式绝大部分均采用电动进样方式。进样通道设计成 与分离通道相垂直交叉 ,但为了提高进样体积 ,进样通道设 计成与分离通道“双 T”的部分重叠。Fluri 等[7 ]即用“双 T” 注射器设计 ,装配在两个 pyrex 玻璃(pyrex 玻璃应以 325 nm 波长激发时显示荧光背景) ,图解见图 4。 图 4 “双 T”注射器设计图解 Chip2CE 的电泳分离有多种分离方式与常规的毛细管 电泳分离方式 ,包括 :自由区带电泳(CZE) 又称自由溶液毛 细管电泳( FSCE) 、毛细管等速电泳(CITP) 、毛细管等电聚 焦电泳(CIEF) 及胶束电动毛细管色谱 (MECC) 等[8 ,9 ]基本 相同。 Chip2CE 的检测 ,由于载面积较小 ,紫外检测段难以实 现 ,一般多采用激光诱导荧光 (Laser2induced fluorescence , L IF) 测定。L IF 检测具有高灵敏度的特点 ,但检测仪器复 杂且样 品 需 进 行 荧 光 标 记 , 影 响 了 其 应 用。2000 年 Wallenborg 等[10 ]报道了胶束电动毛细管色谱的分离方式 在微芯片应用样品不需标记的间接激光诱导荧光检测法。 电化学检测法也用于 Chip2CE 的检测。Wang 等[11 ]用电化 学检测法如安培法、环伏安法、电位法等将电极直接置于 芯片毛细管出口端进行检测。2005 年 , Tsal 等[12 ] 报道了 一种新的微流路芯片毛细管电泳应用三电极电化学检测 器进行检测。此外 ,Walker 等[13 ] 在 Chip2CE 的毛细管等 速电泳中应用拉曼光谱检测器进行检测。 Chip2CE 的商品化仪器 ,许多国外仪器公司已有生产 , 如 Agilent Technologies Inc 和 Caliper Technologies Corp 27 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 6 期
陈执中：新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进起 13 合作提出了Agilent2100生物分析仪(Bioanalyzer),可以 通气口进入MS。每分钟液流为100200l以维持稳定 同时分析12个 DNA或蛋白质样品，30min内即可完成 的电喷雾。用于肌红蛋白测定的微芯片质洁法，检出限度 检测灵敏度可达0.1·岛津公司也推出了微芯片电泳系 低于610~mol/L.样品溶于75%乙醇进行分析也同水 统MCE2010。 溶液样品一样，可以成功地获得很好的灵敏度，多通道赏 芯片系统可让不同的标准肽类和蛋白质样品在一个芯片 2微流路芯片毛细管电泳质谱联用技术 上进行ESEMS分析 1997等Xe等川首先报道了多通道微芯片电喷雾离 1999年Li等5报道了用低死体积连接的微流路芯片 子化质谱法(Microchip electrospray ionization mas: 毛细管电泳质谱法联用技术(Chip-CE-MS).联用技术的 组合设计见图5，发展了一种连接至ESMS接口的低死体 步骤制作 每个缓冲储 积接合设计使其直接插入毛细管柱 液器单独施加高压使每个通道连续喷入样品，经MS样品 a) 的 Supply HV A BC D 30 (1-2/mun (a)用于可任意处置的纳电喷雾发射体(PCRD2设计)：(B)用于传统屏流结构的屏流ESMS接口 图5微流路芯片毛细管电泳质谱法组合设计图解 Figeys等1报道了微流路芯片毛细管电泳串联质谱 3应用 系统(ChipCE-MS/MS)用于蛋白质的自动分析。集成分 析系统见图6。 近年来，随着微流路芯片毛细管电泳技术及商品化仪 器的发展，Chip-CE已在DNA分析细胞分离分析，氨基 分析、生化药物等生物技术和生命科学领域中获得了广污 的应用Chip-ce的应用见表1， 2004年我国大连大学汪洋教授等叫应用中科院大连研 究所研制的CpCE进行了肺癌患者血浆中PI6基因突变 检测，其检测灵敏度高，特异性为96.67%，有助于低丰度 P16甲基化异常的检出，为辅助肺癌早期诊断提供了依据。 L等s应用hipCE ESMS联用技术微通道经 三甲氧硅烷(7ocr下enltrimethoxysilane)硅烷化后再用氯化丙 图6集成分析系统图解 烯酰氨基三甲基铵[(acryloamiro)propytrimethylammonium 9个微流路芯片设计，用传输毛细管连接至离子阱质 cod)]衔生化，进行蛋白质水解产物的快速分析。9种 谱仪(ITMS)和ESI离子源 传输毛细管（长15cm,内花 肽：催产素(oxytocin))甲硫氨酸脑啡肽(Met-enkephalin)完 75μm,外径150μm)的内部表面用子氨基丙烷硅烷（仔 氨酸脑啡肽(Leurenkephalin),bombsin、黄体激素释放激素 aminopropyl silane)衍生化，蚀刻的通道深30um,宽72um, 储液器的直径1mm.样品液流由电子计算机控制的高压转 :)及血管舒缓 送阵列控制。 激肽(brad小vkinin)混合物的分析鉴定，Li等应用Chipr CE MSMS进行肽的序列测定和蛋白质的鉴定， 1994-2007China Academie Joumal Electronic Publishing House.All rights reserved. http://www.cnki.net
合作提出了 Agilent 2100 生物分析仪 (Bioanalyzer) ,可以 同时分析 12 个 DNA 或蛋白质样品 ,30 min 内即可完成 , 检测灵敏度可达 0. 1 ng。岛津公司也推出了微芯片电泳系 统 MCE22010。 2 微流路芯片毛细管电泳2质谱联用技术 1997 等 Xue 等[14 ]首先报道了多通道微芯片电喷雾离 子 化 质 谱 法 ( Microchip electrospray ionization mass spectrometry ,chip2ESI2MS) 。微芯片装置是用标准照相平 板印刻的。湿化学腐蚀和热合成步骤制作。每个缓冲储 液器单独施加高压使每个通道连续喷入样品 ,经 MS 样品 通气口进入 MS。每分钟液流为 100～200 nl 以维持稳定 的电喷雾。用于肌红蛋白测定的微芯片质谱法 ,检出限度 低于 6 ×10 - 8 mol/ L 。样品溶于 75 %乙醇进行分析也同水 溶液样品一样 ,可以成功地获得很好的灵敏度。多通道微 芯片系统可让不同的标准肽类和蛋白质样品在一个芯片 上进行 ESI2MS 分析。 1999 年 Li 等[15 ]报道了用低死体积连接的微流路芯片 毛细管电泳2质谱法联用技术 (Chip2CE2MS) 。联用技术的 组合设计见图 5 ,发展了一种连接至 ESMS 接口的低死体 积接合设计使其直接插入毛细管柱。 (a) 用于可任意处置的纳电喷雾发射体( PCRD2 设计) ; (b) 用于传统屏流结构的屏流 ESMS 接口 图 5 微流路芯片毛细管电泳2质谱法组合设计图解 Figeys 等[16 ]报道了微流路芯片毛细管电泳2串联质谱 系统(Chip2CE2MS/ MS) 用于蛋白质的自动分析。集成分 析系统见图 6。 图 6 集成分析系统图解 9 个微流路芯片设计 ,用传输毛细管连接至离子阱质 谱仪(ITMS) 和 ESI 离子源。传输毛细管 (长 15 cm ,内径 75μm ,外径 150 μm) 的内部表面用 32氨基丙烷硅烷 (32 aminopropyl silane) 衍生化 ,蚀刻的通道深 30μm ,宽72μm , 储液器的直径1 mm。样品液流由电子计算机控制的高压转 送阵列控制。 3 应 用 近年来 ,随着微流路芯片毛细管电泳技术及商品化仪 器的发展 ,Chip2CE 已在 DNA 分析、细胞分离分析、氨基酸 分析、生化药物等生物技术和生命科学领域中获得了广泛 的应用 ,Chip2CE 的应用见表 1。 2004 年我国大连大学汪洋教授等[24 ]应用中科院大连研 究所研制的 Chip2CE 进行了肺癌患者血浆中 P16 基因突变 检测 ,其检测灵敏度高 ,特异性为 96. 67 % ,有助于低丰度 P16 甲基化异常的检出 ,为辅助肺癌早期诊断提供了依据。 Li 等[15]应用 Chip2CE2ESMS联用技术 ,微通道经 72辛烯212 三甲氧硅烷(72oct212enyltrimethoxysilane) 硅烷化后再用氯化丙 烯酰氨基三甲基铵 [ (acryloamino) propyl2trimethylammonium chloride) ]衍生化 ,进行蛋白质水解产物的快速分析。9 种 肽 :催产素(oxytocin) 、甲硫氨酸 脑啡肽(Met2enkephalin) 、亮 氨酸 脑啡肽(Leu2enkephalin) 、bombsin、黄体激素释放激素 (L HRH) 、精氨酸 82后叶加压素 (Arg82vasopressin) 、血管舒 缓激肽 125 (bradykinin125) 、p 物质(substance P) 及血管舒缓 激肽(bradykinin) 混合物的分析鉴定。Li 等应用 Chip2CE2 MS/ MS 进行肽的序列测定和蛋白质的鉴定。 陈执中 :新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进展 37
74 药物生物技术 第13卷第6期 表1 Chip-CE的应用 []Heab B B.Mathies RA.detection f DNA 领域 分析项且 测定方法 文然 生化氨基酸 循环柱切换的微流路芯【17刀 99 药物 片，微通道表面用线性紧 3 A T.Math 内稀酰截衍生化进行 r the production of capillary array electrophores MECC分离测定 chips IJ. e,1998,1(1:7 氨基酸 OPA柱后衍生化分离测定【71 [4 I Fan Z H,Harrison D J.Micromachinning of capillary 氢基酸 用CZ正分离测定，荧光标【8] electrophoresis injectors and separators on glass chips and 记氨基酸 evaluation of flow at capillary intersectionsJ.A mal Chem 1994,66(1:177. [5 Moor A W.Jacobson S C.Ramsey J M.Microchip 酶抑制剂 合成 箭解后用LIF检测荧光强 separations of neutral species via micellar electrokineti [20] capillary chromatography 4nal Chem67():4184. (tacrine. 度的降低以测定其含量 药物 I6 1 Heiger D N.High perfo edrophonium) introduction1992中译本：孙亦梁：高效毛细管电泳导论 [21] 1I.199323 的反 7 Fluri K.Fitzpatrick G.Chiem N,er al.Intergrated capillar electrophoresis device with an efficient postoolumn reactor in plana 茶碱和茶碱单用荧光标记的茶碱和茶碱 [221 and elass chin In nl Cm 1996 68(23)4285 克隆抗体分析竞争抗体法测定 【8】陈执中，幸月华.高效毛细管电在生物技术产品分析研究重点 DNA序列测定聚丙酰胺衍生化以聚丙 23] 俄脚用讲层用结物生物特求10331)，》 陆胺为机制定500个 [9】陈执中，章月华，高效毛细管电泳法在临床药学中的应用进展 破基的DNA序列 [10 S R.Bailey C G.Sepa Fg9ys等1应用微流路芯片毛细管电泳串联质谱，芯 片道道用>氨基丙基硅 电子计算机控制进行蛋白质的自动分析。不仅仅限于蛋白 1872 质的鉴定且可扩展用于蛋白质配位体复合物的分析和蛋白 质修饰的测定。 etector 4ma 4结语 12 Lin KW,et al.A new fabric on process for ntegrated with th 综上所述，微流路芯片毛细管电泳是近几年才发展的分 s.2005,26:300 离分析新技术。虽然历史较短，但由于这一新技术具有微型 [13] Walker P A.Morris M D. Isotachophoresis separation in a 化（有效通道通常仅为几个c),较常规电泳所需电压低（仅 raman spectroscopy detection I JI.Amal 几个kV):快速（氨基酸、多肽，蛋白质的分离时间仅需数秒 Chem,1998,70(18):3766 DNA的分离时间为310mi):高效（分离氨基酸和牛血清 [14]Xue Q.Foret F,Dunayevskity YM,er al.Multichannel microch 白蛋白理论塔板数可达830O0。寡核苷酸分离的理论塔机 dectrospray mass spoctrometry I.Amal Chem 1997,69(3)426 数可达2950000)：微量( 一般样品用量， <10川，浓度约为 [15]Li J,Thibault P,Bings N H,er al.Integration of microfabricated devices to capillary electrophoresis S0uo/L),而且应用范围广，可用于氨基酸、多肽、蛋白质 electrosoray mass spectrometry using a low dead wolume DNA及察核苷酸的分离DNA测序基因突变检测用于医 connection:application to rapid analysis of proteolytic digests 学诊断，可用于蛋白质分子量的自动分析等优 1.A nal Chem,1999,71(15):3036. 点，使其在生物技术和生命科学领域中获得了应用 [16]Figeys D.Cgi S P.Mekinnon G.er al.An integrated 参考文献 microfluidics tandem mass spectrometry system for automated [1]Mang A.Harrison DJ.Verpoorte EMJ etal.Planat chip [17]Heeren F,Verpoorte E.Manz A.a.Micellar techpoloay for miniaturization and inteeration of separation eectrokinetic chromatography separation and analysis of phoresis mic 1992,5931-2:253 Chem,1996,6813:2044 1994-2007 China Academic Joumal Electronic Publishing House.All rights reserved http://www.cnki.net
表 1 Chip2CE 的应用 领域 分析项目 测定方法 文献 生化 药物 氨基酸 循环柱切换的微流路芯 片 ,微通道表面用线性聚 丙烯 酰 胺 衍 生 化 进 行 MECC 分离测定 [ 17 ] 氨基酸 OPA 柱后衍生化分离测定 [ 7 ] 氨基酸 用 CZE 分离测定 ,荧光标 记氨基酸 [ 18 ] 多巴胺、肾上 腺素及儿茶酚 用 CZE 分离 ,铂2铂2银/ 氯 化银三电极安培法测定 [ 19 ] 合成 药物 酶抑制剂 (tacrine , edrophonium) 酶解后用LIF 检测荧光强 度的降低以测定其含量 [ 20 ] 生物 医学 酵母菌、大肠 杆菌及红细胞 微通道用三氯十六烷基硅 烷化处理进行细胞的反 应、运输及分离 [ 21 ] 茶碱和茶碱单 克隆抗体分析 用荧光标记的茶碱和茶碱 竞争抗体法测定 [ 22 ] DNA 序列测定 聚丙烯酰胺衍生化以聚丙 烯酰胺为机制测定 500 个 碱基的 DNA 序列 [ 23 ] Figeys 等[16 ]应用微流路芯片毛细管电泳2串联质谱 ,芯 片通道用 32氨基丙基硅烷(32aminopropyl silane) 硅烷化后以 电子计算机控制进行蛋白质的自动分析。不仅仅限于蛋白 质的鉴定且可扩展用于蛋白质 配位体复合物的分析和蛋白 质修饰的测定。 4 结 语 综上所述 ,微流路芯片毛细管电泳是近几年才发展的分 离分析新技术。虽然历史较短 ,但由于这一新技术具有微型 化(有效通道通常仅为几个 cm) ,较常规电泳所需电压低(仅 几个 kV) ;快速(氨基酸、多肽、蛋白质的分离时间仅需数秒 , DNA 的分离时间为 3～10 min) ;高效(分离氨基酸和牛血清 白蛋白理论塔板数可达 83 000。寡核苷酸分离的理论塔板 数可达 2 950 000) ;微量(一般样品用量 , < 10μl ,浓度约为 50μmol/ L) ,而且应用范围广 ,可用于氨基酸、多肽、蛋白质、 DNA 及寡核苷酸的分离 ,DNA 测序 ,基因突变检测用于医 学诊断。Chip2CE2MS 可用于蛋白质分子量的自动分析等优 点 ,使其在生物技术和生命科学领域中获得了应用。 参考文献 [ 1 ] Manz A , Harrison D J , Verpoorte E M J , et al . Planar chip technology for miniaturization and integration of separation techniques into monitoring system. Capillary electrophoresis on chip [ J] . J Chromatogr , 1992 , 593 (1 2) : 253. [ 2 ] Heab B B , Mathies R A. Single2molecule detection of DNA separation in microfabricate capillary electrophoresis chip employing focused molecular streems [ J] . Anal Chem , 1999 , 41(22) : 5137. [ 3 ] Sinpson P C , Wooley A T , Mathies R A. Microfabrication technologe for the production of capillary array electrophoresis chips [ J] . Biomed Microdevice , 1998 , 1 (1) : 7. [ 4 ] Fan Z H , Harrison D J. Micromachinning of capillary electrophoresis injectors and separators on glass chips and evaluation of flow at capillary intersections [ J] . A nal Chem , 1994 , 66 (1) : 177. [ 5 ] Moor A W , J acobson S C , Ramsey J M. Microchip separations of neutral species via micellar electrokinetic capillary chromatography [ J] . Anal Chem , 1995 , 67(22) : 4184. [ 6 ] Heiger D N. High performance capillary electrophoresis2and introduction 1992 ,中译本 : 孙亦梁 : 高效毛细管电泳导论 [ M] . 1993 , 23. [ 7 ] Fluri K, Fitzpatrick G, Chiem N , et al. Intergrated capillary electrophoresis device with an efficient postcolumn reactor in planar quarts and glass chip [ J] . Anal Chem , 1996 , 68(23) :4285. [ 8 ] 陈执中 ,章月华. 高效毛细管电在生物技术产品分析研究重点 俄应用进展[ J] . 药物生物技术 ,1995 ,2 (1) :52. [ 9 ] 陈执中 ,章月华. 高效毛细管电泳法在临床药学中的应用进展 [ J] . 临床药学 ,1995 ,4 (1) :24. [ 10 ] Wallenborg S R , Bailey C G , Separation and detection of explosive on microchip using micellar electrokinetic chromatography and indirect laser2induced fluorescence [ J] . A nal Chem , 2000 , 72 (8) : 1872. [ 11 ] Wong J , Tian B M , Sahlin E. Micromachined electrophoresis chips wit h t hick film electrochemical detector [ J ] . A nal Chem , 1999 , 71 (23) : 5436. [ 12 ] Tsal D M , Lin KW , et al. A new fabrication process for a microchip electrophoresis device integrated with a three2electrode electrochemical detector [ J] . Electrophoresis , 2005 , 26 : 3007. [ 13 ] Walker P A , Morris M D. Isotachophoresis separation in a microchip normal raman spectroscopy detection [ J] . A nal Chem ,1998 , 70 (18) : 3766. [ 14 ] Xue Q , Foret F , Dunayevskity Y M , et al. Multichannel microchip electrospray mass spectrometry [J] . Anal Chem , 1997 , 69(3) : 426. [ 15 ] Li J , Thibault P , Bings N H , et al . Integration of microfabricated devices to capillary electrophoresis2 electrospray mass spectrometry using a low dead volume connection : application to rapid analysis of proteolytic digests [ J] . A nal Chem , 1999 , 71 (15) : 3036. [ 16 ] Figeys D , Gygi S P , Mckinnon G, et al. An integrated microfluidics2tandem mass spectrometry system for automated protein analysis [ J] . A nal Chem , 1998 , 70(18) : 3726. [ 17 ] Heeren F , Verpoorte E , Manz A , et al . Micellar electrokinetic chromatography separation and analysis of biological samples on a cyclic planar microstructure [ J] . A nal Chem , 1996 , 68 (13) : 2044. 47 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 6 期
陈执中：新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进展 75 [18]Seriler K,Harrison D J,Manz A.Planar glass chip for capillary IJ1.A nal Chem,1997,69(8):1564. electrophoresis:repetitive sample injection quantitation and [22]Chiem N,Harrison D J.Microchip-based capillaru separation efficiency I Jl.A nal Chem,1993,65:1481. electrophoresis for immunoassats:analysis of monoclonal antiboies [19]Woolley A T,Lao K L,Gazer A N,et al.Capillary and theophylline.Anal Chem,1997,69(3):373. electrophoresis chip with integrated electrochemical detection [23]Woolley A T,Mathies R A.Ultra-highrspeed DNA 1J.A nal Chem,1998,70(4):684. sequencing using capillary electrophoresis chip JI.Anal [20 Hadd A G,Jacobson S C,Ramsey M.Microfluidic assays of Chem,1995,67(20):3676. acetylcholinestrerase inhibitors Anal Chem,1997,71(22):5206. 「24】汪洋，邹丽娟，许冠东，等.微流控片检测肺癌患者血浆中P16 (21]Li P C H,Harrison D J.Transport,manipulation and 基因异常甲基化在临床以用的评价1).生物化学与生物物理 reaction of biological cells omchip using electrokinetic effects 进展，2004,31(12)：1085 Progress on the Study and Applications of Ne w Microchips Capillary Flectrophoresis and Its Combining Techniques CHEN Zhi-zhong (School of Pharmacy.Fudan University,Shanghai 200032,China) Abstract Microfludics chip capillarying electrophoresis Chip-CE)is a new technique used as a microcapillary separation which developing in later stage of the ninety in the 20h century.The microfludics chip capillary electrophoresis mass spectrometry (Chip-CE MS)combining techniques are a forward of development in many combining techniques of instrumental analysis.The progress on the studies of Chip-CE including the separation principles,devices and techniques of determination and Chip-CE MS combining techniques as well as the applications of these techniques in the fields of biotechnology and life science is reviewed. Key words Chip-CE,Combining techniques,DNA analysis,Detection of gene mutation,Proteins and polypeptide analysis •信 息· 2007-07纳米丝素颗粒的制造方法用蚕丝纤维加工技术可以生产粒径约为35~125m的球形丝素纳米颗粒。这 种结晶性丝蛋白纳米颗粒由再生液体蚕丝直接加工而成。该项技术具有加工工艺简单加工试剂可再生循环利用、生产成 本低、加工工艺绿色环保等特点。克服了目前市场上的丝素粉末大多来自于丝纤维的机械粉碎，受现有粉碎技术的限制， 很难获得低于微米级的丝素超微颗粒，不仅颗粒大，而且粒度分布宽、形状各异表面粗糙等缺陷。为蚕丝粉末的深度开发 尤其在生物医用材料方面创造了条件。利用该发明技术获取的丝素纳米颗粒结晶度接近天然纤维，不溶于水而能悬浮在 水或水溶液中。这种蛋白颗粒由十八种氨基酸组成，能强力抵抗紫外线辐射和体内、体外蛋白酶的消化。因球形颗粒的表 面有许多活性基团，用化学或物理方法可与酶、多肽等药物生物连接，在药物缓释系统中具有潜在的应用价值。这种丝蛋 白纳米颗粒可以商业化生产，广泛应用于医用生物材料、高级化妆品抗紫外护肤品，表面改性材料等。 200708中科院上海生命科学研究院与德国合作发明MLK技术中科院上海生命科学研究院马普计算生物学研 究所，由中国科学院和德国马普学会共同成立，是德国马普学会在中国的第一个伙伴研究所。最近，他们合作研究了应用 多维自动荧光显微技术分析蛋白质的拓扑结构和功能。科研人员利用多抗原配体图谱(M日技术，研究细胞内蛋白质 在时间~空间上的排列及其与细胞功能的相关性，这项新技术可以同时在单细胞内检测跟踪上百个蛋白质，从而使细胞生 物学研究步人了拓扑研究的时代。科研人员还运用M日K技术分析癌症、慢性疼痛和牛皮癣三种疾病，得到了大量的复 杂数据，并发展了处理这些复杂数据的基本理论概念和计算方法。研究成果显示，MELK技术可用于识别人类疾病的新诊 断标记，寻找治疗靶标，确定组成蛋白质网络的蛋白的定位。 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
[18 ] Seriler K, Harrison D J , Manz A. Planar glass chip for capillary electrophoresis: repetitive sample injection quantitation and separation efficiency [ J] . A nal Chem , 1993 , 65 : 1481. [ 19 ] Woolley A T , Lao K L , Glazer A N , et al . Capillary electrophoresis chip wit h integrated electrochemical detection [ J] . A nal Chem , 1998 , 70 (4) : 684. [ 20 ] Hadd A G, Jacobson S C, Ramsey M. Microfluidic assays of acetylcholinestrerase inhibitors [J] . Anal Chem , 1997 , 71(22) : 5206. [ 21 ] Li P C H , Harrison D J. Transport , manipulation and reaction of biological cells on2chip using electrokinetic effects [ J] . A nal Chem , 1997 , 69 (8) : 1564. [ 22 ] Chiem N , Harrison D J. Microchip2based capillaru electrophoresis for immunoassats: analysis of monoclonal antiboies and theophylline [ J] . A nal Chem , 1997 , 69(3) : 373. [ 23 ] Woolley A T , Mat hies R A. Ultra2high2speed DNA sequencing using capillary electrophoresis chip [ J] . A nal Chem , 1995 , 67 (20) : 3676. [ 24 ] 汪洋 ,邹丽娟 ,许冠东 ,等. 微流控片检测肺癌患者血浆中 P16 基因异常甲基化在临床以用的评价[ J] . 生物化学与生物物理 进展 ,2004 ,31 (12) :1085. Progress on the Study and Applications of New Microchips Capillary Electrophoresis and Its Combining Techniques CH EN Zhi2zhong ( S chool of Pharmacy , Fu d an Uni versit y , S hang hai 200032 , Chi na) Abstract Microfludics chip capillarying electrop horesis ( Chip2CE) is a new technique used as a microcapillary separation which developing in later stage of the ninety in the 20 th century. The microfludics chip capillary electrophoresis2mass spectrometry (Chip2CE2MS) combining techniques are a forward of development in many combining techniques of instrumental analysis. The progress on the studies of Chip2CE including the separation principles , devices and techniques of determination and Chip2CE2MS combining techniques as well as the applications of these techniques in the fields of biotechnology and life science is reviewed. Key words Chip2CE , Combining techniques , DNA analysis , Detection of gene mutation , Proteins and polypeptide analysis ·信 息 · 2007207 纳米丝素颗粒的制造方法 用蚕丝纤维加工技术可以生产粒径约为 35～125nm 的球形丝素纳米颗粒。这 种结晶性丝蛋白纳米颗粒由再生液体蚕丝直接加工而成。该项技术具有加工工艺简单、加工试剂可再生循环利用、生产成 本低、加工工艺绿色环保等特点。克服了目前市场上的丝素粉末大多来自于丝纤维的机械粉碎 ,受现有粉碎技术的限制 , 很难获得低于微米级的丝素超微颗粒 ,不仅颗粒大 ,而且粒度分布宽、形状各异、表面粗糙等缺陷。为蚕丝粉末的深度开发 尤其在生物医用材料方面创造了条件。利用该发明技术获取的丝素纳米颗粒结晶度接近天然纤维 ,不溶于水而能悬浮在 水或水溶液中。这种蛋白颗粒由十八种氨基酸组成 ,能强力抵抗紫外线辐射和体内、体外蛋白酶的消化。因球形颗粒的表 面有许多活性基团 ,用化学或物理方法可与酶、多肽等药物生物连接 ,在药物缓释系统中具有潜在的应用价值。这种丝蛋 白纳米颗粒可以商业化生产 ,广泛应用于医用生物材料、高级化妆品、抗紫外护肤品、表面改性材料等。 2007208 中科院上海生命科学研究院与德国合作发明 MEL K技术 中科院上海生命科学研究院马普计算生物学研 究所 ,由中国科学院和德国马普学会共同成立 ,是德国马普学会在中国的第一个伙伴研究所。最近 ,他们合作研究了应用 多维自动荧光显微技术分析蛋白质的拓扑结构和功能。科研人员利用多抗原配体图谱 (MEL K) 技术 ,研究细胞内蛋白质 在时间 空间上的排列及其与细胞功能的相关性 ,这项新技术可以同时在单细胞内检测跟踪上百个蛋白质 ,从而使细胞生 物学研究步人了拓扑研究的时代。科研人员还运用 MEL K 技术分析癌症、慢性疼痛和牛皮癣三种疾病 ,得到了大量的复 杂数据 ,并发展了处理这些复杂数据的基本理论概念和计算方法。研究成果显示 ,MEL K技术可用于识别人类疾病的新诊 断标记 ,寻找治疗靶标 ,确定组成蛋白质网络的蛋白的定位。 陈执中 :新的芯片毛细管电泳及其联用技术研究应用进展 57