微生物培养基的配置与灭菌 培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方 法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和 生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条 件：(1)适当组分和比例的营养物质：(2)适宜的pH值：(3)合 适的渗透压；(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需 的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之 一。 培养基的种类： 根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类： 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而 成。 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。 从培养基的物理状态来分： 液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状培 养基或固体状农副产品培养基。 半固体培养基：在液体培养基中加入0.2%-0.5%凝固剂而成的 半固体状培养基。 微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。 它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从
海藻中（主要是石花莱）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要 成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度 下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃ 以下，又凝固为固体。 (一)、培养基配制 1.培养基配制的一般方法和步骤 (1)称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于塘瓷杯中。 (2)溶化：在塘瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或 自来水)，用玻棒搅匀，加热溶解。 (3)调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调)，用1 N NaOH或1NHC 调pH,用pH试纸对照。 (4)加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不 要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少， 时间短不必补水。 (5)分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜 面的装置为管高的1/5特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上 以免浸湿棉塞，引起污染。 (6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸 包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。 (7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜 面。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24h,如确 无菌生长、方可使用
注：无菌水的制备：100ml三角瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL 试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预 先塞好棉塞，并经千热灭菌。 (二)分离培养微生物常用器皿的准备 1.清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。 2.棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉 花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气 中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也 要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约1-1.5cm 长)以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得 松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。 教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松， 两头光滑。试管棉塞的长度约3cm左右。塞入试管内部分约占2/3， 头部稍大约占1/3左右。 试管棉塞的规范要求 1.正确式样2.管内部分太短，管外部分太松3.外部过小 4.整个棉塞太松5.管内部分过紧，外部太松 3.包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸常、三角玻棒等洗净， 千热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用 旧报纸包装妥当，每组同学包培养皿6只（一包）。 吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在45cm宽的长纸条的一端， 约成45°角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身
右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩 余纸条，折叠打结，准备灭菌。 吸管灭菌前用纸包卷示意图 (三)培养基和玻璃器材的灭菌方法 灭菌的方法，通常可以分为四大类：(1)加热灭菌：包括直接 灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歌灭菌和煮沸消毒：(2) 过滤去菌：(3)射线灭菌和消毒：(4)化学药剂灭菌和消毒。 在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。 【.干热灭菌法（即热空气灭菌法） 干热灭菌一般是利用电热烘箱作为千热灭菌器。前面所包装好的玻璃 器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电 热烘箱中。 打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃ ~170℃，关闭通气孔使箱内的温度保持在160℃左右并维持1.5-2。 时间一到，切断电源。待温度下降60℃70℃以下，方可打开箱门取 灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。 2.加压蒸气灭菌法 利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高， 来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。 在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿 热情况下，易干凝固。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物
品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与 水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。 手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下： (1)在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。 将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。 (2)接通电源，进行加热。 (3)当压力到达5bl/i2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽 一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。 (4)当压力表大的压力到达15b1/in2(即1.05kg/cm2)时，此时 灭菌器内的温度达到121℃，维持30min不变。对热不稳定的培养基 灭菌时，应适当降低压力，延长时间。 (5)灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气 孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成 斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。 3.间歌灭菌法 常采用阿诺(Arnold)氏灭菌器和柯赫(Koch)氏灭菌器或蒸笼 灭菌，常压条件下蒸汽温度不超过100℃。在没有高压灭菌器设备的 情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。 方法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每d蒸煮1次，每次煮沸 Ih,连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放 在37心恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死的残留茅 孢萌发成营养体，以便下1次蒸煮时杀灭
4.过滤除菌法 一些不能加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），可以用过滤 除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。（教师示范） 细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼 很小，细菌不能通过。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过 滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须要包装妥当并进 行加压蒸汽灭菌后方可使用。 下面介绍石棉板滤器的枸造及其操作方法。石棉板滤器又称蔡氏 (Scitz)滤器，它是由石棉制成的圆形滤板和一个特制漏斗组成。 此漏斗分上下两节。上节为圈形金属筒，下节为金属漏斗。两节由三 个活动螺旋固定，便于装卸。使用时拆开两节，将滤板放在漏斗上的 金属筛板，再加上上节，然后将螺旋扭紧，将欲滤溶液置于滤器中抽 滤。每次过滤必须用一张无菌的新滤板。石棉板滤器因容积大小不同 而有各种型号，石棉板也有不同规格型号使用时必须根据需要搭配妥 当。图6一6过滤除菌装置a.蔡氏过滤器b.注射器滤器装置 5.紫外线灭菌 波长260~280m之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管 能产生253.7m的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱一般只适宜 物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等 空气灭菌。一般30w灯管、9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照 射0.5，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化 学消毒剂，可增强灭菌效果
在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室 (箱)空气、台面等处的微生物。（参观示范） 紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力较弱，即使一薄层玻璃或水层就 能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 紫外线对眼粘膜及视神经有强烈的损伤作用，对皮肤有刺激作用，所 以不能直接在紫外线灯开启下工作和用眼睛直视开启的紫外灯。 6.化学药剂消毒灭菌 微生物实验室中常用的化学杀茵剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒 精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们 有的是杀菌剂，有的是抑菌剂