实验六: 肌苷的分析
实验六： 肌苷的分析
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 肌苷 N NH HO N N OHOH 圆目片 9β-D-核糖次黄嘌呤 SHDYE CA 肌苷在体内参与细胞能量代谢和蛋白质合成,提高相关代谢 酶的活性,改善肝脏功能,促进受损肝脏的恢复。肌苷片用于急 慢性肝炎的辅助治疗,规格:0.2g
肌苷 9b-D-核糖次黄嘌呤 肌苷在体内参与细胞能量代谢和蛋白质合成，提高相关代谢 酶的活性，改善肝脏功能，促进受损肝脏的恢复。肌苷片用于急、 慢性肝炎的辅助治疗，规格：0.2g
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 、鉴定 1、取本品2片,研细,加水10m溶解,滤过,取滤液1m, 等体积3,5-二羟基甲苯溶液(含盐酸,Fe3),混匀,在水浴 中加热约10min,即显绿色--鉴别核糖 肌苷_町→>核糖—"糖醛3·羟咩苯绿色配合物 2、取本品饱和水溶液2mL(可直接取鉴别1中的滤液), 加氨制硝酸银试液数滴,即产生白色胶状沉淀--鉴别嘌呤 碱基 嘌呤碱+AgNO3-水嘌呤碱银化物↓
一、鉴定 2、取本品饱和水溶液2mL（可直接取鉴别1中的滤液）， 加氨制硝酸银试液数滴，即产生白色胶状沉淀----鉴别嘌呤 碱基 1、取本品2片，研细，加水10ml溶解，滤过，取滤液1ml， 等体积 3,5-二羟基甲苯溶液(含盐酸，Fe3+)，混匀，在水浴 中加热约10min，即显绿色----鉴别核糖 3 3,5- Fe ⎯⎯→ ⎯⎯→ ⎯⎯⎯⎯⎯→ + + + 肌苷 H H 核糖 糖醛 二羟基甲苯 绿色配合物 +AgNO3 ⎯⎯⎯→ 嘌呤碱 浓氨水 嘌呤碱银化物
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 3、将本品配成10μg/mL的溶液,在200-400mm波长内扫描,在 248nm±1nm处有最大吸收,在22nm士1mm处有最小吸收。 溶液配制:取10片肌苷片,精密称定,计算平均每片质量, 研细,精密称取适量(相当于肌苷0.lg),置于100m容量瓶, 加水充分振摇溶解,用水稀释至刻度,滤过。精密量取续滤 液1.0mL,置100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,制成每ml 约含10μg的溶液。 波长(m)20021021522022225230240245 吸光度 波长(mm248250255260270300330360400 吸光度
3、将本品配成10mg/mL的溶液，在200-400nm波长内扫描，在 248nm±1nm处有最大吸收，在222nm±1nm处有最小吸收。 波长(nm) 200 210 215 220 222 225 230 240 245 吸光度 波长(nm) 248 250 255 260 270 300 330 360 400 吸光度 溶液配制：取10片肌苷片，精密称定，计算平均每片质量， 研细，精密称取适量（相当于肌苷0.1g），置于100ml容量瓶， 加水充分振摇溶解，用水稀释至刻度，滤过。精密量取续滤 液1.0mL ， 置100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，制成每ml 约含10mg的溶液
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 、次黄嘌呤的检査 HO HO N OH OH 精密称取本品0.5g,置50mL量瓶,加水溶解并稀释至刻度,摇匀过 滤,取续滤液(已配制),吸取上述溶液IμL(毛细管高度约3mm即 可),以次黄嘌呤的饱和水溶液为对照品,分别点于3cm×20cm层析滤 纸上,以水为展开剂,上行展开至6~7cm处,取出晾干,于紫外灯254mm 下检视,不得出现杂质斑点。 肌苷 ←次黄嘌呤
二、次黄嘌呤的检查 精密称取本品0.5g，置50mL量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀过 滤，取续滤液（已配制），吸取上述溶液1mL（毛细管高度约3mm即 可），以次黄嘌呤的饱和水溶液为对照品，分别点于3cm ×20cm层析滤 纸上，以水为展开剂，上行展开至6~7cm处，取出晾干，于紫外灯254nm 下检视，不得出现杂质斑点。 肌苷 次黄嘌呤 +
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 、含量测定(紫外分光光度法) 吸收系数法: 过程:W(g)样/含i一解>C(g/mL)知→求A→C1 [8/m]= A2 Eo×100 取鉴定3中的溶液,测定248nm士1mm附近的最大吸光度, 已知肌苷的百分吸收系数为460,根据朗伯比尔定律。 cm 计算肌苷片的含量,并与标示量比较
三、含量测定（紫外分光光度法） 取鉴定3中的溶液，测定248nm±1nm附近的最大吸光度， 已知肌苷的百分吸收系数 为460，根据朗伯比尔定律。 计算肌苷片的含量，并与标示量比较。 1% E1cm ( ) / ( / ) E W g i C g mL A C ⎯⎯⎯→ ⎯⎯⎯→ i 过程： 样 含 稀释 已知 求 1% 1 [ / ] 100 x x cm A C g mL E = 吸收系数法：
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 四、操作要点 1纸色谱检查中,起始样点面积尽可能小,否则展开后斑点扩散 严重,影响观察; 2氨制硝酸银实验观察到现象后立即清洗试管; 3.本实验用吸光系数法测定含量,其优点是操作简便、快捷, 不必用对照品。但该法受仪器精度、操作及环境因素等影响较 大,因此测定前必须对紫外可见分光光度计进行校正与检定, 波长、吸光度的准确度、杂散光均应符合要求,才能保证结果 的准确
四、操作要点 1.纸色谱检查中，起始样点面积尽可能小，否则展开后斑点扩散 严重，影响观察； 2.氨制硝酸银实验观察到现象后立即清洗试管； 3. 本实验用吸光系数法测定含量，其优点是操作简便、快捷， 不必用对照品。但该法受仪器精度、操作及环境因素等影响较 大，因此测定前必须对紫外-可见分光光度计进行校正与检定， 波长、吸光度的准确度、杂散光均应符合要求，才能保证结果 的准确
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 附录:2010版药典中肌苷的分析方法 【鉴别】(1)取0.01%供试品溶液适量,加等体积的3, 肌苷 5二羟基甲苯溶液(取3,5二羟基甲苯与三氯化铁各0.1 加盐酸使成100ml),混匀,在水浴中加热约10分钟,即显 Jigan 绿色 Inosine (2)在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的 保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致 (3)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱(光谱集605 HN 图)一致 【检查】溶液的透光率取本品0.5g,加水50ml使溶 解,照紫外可见分光光度法(附录ⅣA),在430nm的波长处 测定透光率,不得低于98.0%(供注射用)。 OH OH 有关物质取本品,加水制成每1ml中含0.5mg的溶 CmnH2NO3268.23:液,作为供试品溶液;稍密量取lm,置100m1量瓶中,加水稀 本品为驴D核糖次黄嘌呤。按干燥品计算,含:释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条 C1H12N4O4应为98.0%~102.0%。 件取对照溶液20μl注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主 【性状】本品为白色结晶性粉末;无臭,味微苦。氵成分峰的峰高约为满量程的20%,再精密量取供试品溶液与 本品在水中略溶在乙醇中不溶,在稀盐酸和氢氧化钠试:对照溶液各20l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保 液中易溶。 留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,各杂质峰 面积的和不得大于对照溶液的主峰面积(1.0%)
附录：2010版药典中肌苷的分析方法
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 干燥失置取本品,在105℃干燥至恒重减失重量不得:【类别】细胞代谢改善药。 过1.0%(附录ⅧL)。 【贮藏】遮光,密闭保存。 炽灼残渣不得过0.1%(供注射用),或不得过02%:【制剂】(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷胶囊 (供口服用)(附录ⅧN)。 (4)肌苷注射液(5)肌苷葡萄糖注射液(6)肌苷氯化钠 重金属取本品1.0g,依法检查(附录ⅧH第二法),含:注射液(7)注射用肌苷 重金属不得过百万分之十 异常毒性取本品,加氯化钠注射液制成每1ml中含 10mg的溶液,依法检查(附录C),按静脉注射法给药,应符 合规定(供注射用)。 【含量测定】照高效液相色谱法(附录VD)测定。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶 为填充剂;以甲醇-水(10:90)为流动相;检测波长为248mm 取肌苷对照品约10mg,80℃水浴加热10分钟,放冷,加水至 50ml,取20ml注入液相色谱仪,肌苷峰与相邻杂质峰的分离 度应符合要求,理论板数按肌苷峰计算不小于2000 测定法取本品适量精密称定,加水溶解并定量稀释制 成每1ml中约含20ug的溶液,摇匀,精密量取20l注入液相 色谱仪,记录色谱图;另精密称取肌苷对照品适量,同法测定, 按外标法以峰面积计算,即得
足医科大 FUJIAN MEDICAL UNIVERSITY 苷片 Jigan Pian 10μg的溶液,同法测定,计算每片的溶出量。限度为标示量 Inosine Tablets 的80%应符合规定。 其他应符合片剂项下有关的各项规定(附录IA)。 本品含肌苷(C0H2N4O3)应为标示量的93.0% 【含量测定】取本品10片(如为糖衣片,应除去包 107.0% 衣),精密称定,研细,精密称取适量(约相当于肌苷 【性状】本品为白色片或糖衣片或薄膜衣片,除去句x;01g),置100m1量瓶中,加水约70ml,充分振摇使肌苷溶 后显白色。 解,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液2ml,置 【鉴别】(1)取本品2片,研细,加水10ml振摇使溶: 100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,照肌苷项下的方法 解,滤过,取滤液,照肌苷项下的鉴别(1)项试验,显相同的:测定,计算,即得 反应 【类别】同肌苷 (2)在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的 【规格】0.2g 保留吋间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。 【贮藏】遮光,密封保存。 【检查】溶出度取本品照溶出度测定法(附录XC第 法),以水900ml为溶出介质,转速为每分钟75转,依法操: 作,经30分钟时,取溶液10ml,滤过,精密量取续滤液5ml,置 100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,照紫外可见分光光度 法(附录ⅣA),在248mm的波长处测定吸光度;另取肌苷对 照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1m中约含: