第3章高效液相色谱分析法HPLC (High Pertormance Liquid Chromatography, §3-1高效液相色谱法的特点 §3-2基本理论和条件选择 §3-3各类高效液相色谱法简介 §3-4液相色谱的流动相 §3-5高效液相色谱仪
第3章 高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid Chromatography，） §3-1 高效液相色谱法的特点 §3-2 基本理论和条件选择 §3-3 各类高效液相色谱法简介 §3-4 液相色谱的流动相 §3-5 高效液相色谱仪
§3-1高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法：流动相一液体（也称洗脱液) 在经典色谱法的基础上引入气相色谱的理论，技术 上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，建立 了分析速度快、分离效率高和灵敏度高的色谱方法。 高压：150-350×105Pa 高速：1-10mL/min 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g(紫外检测)、1011g（荧光检测)
高效液相色谱法：流动相——液体（也称洗脱液） 在经典色谱法的基础上引入气相色谱的理论，技术 上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，建立 了分析速度快、分离效率高和灵敏度高的色谱方法。 高压：150-350×105 Pa 高速：1-10 mL/min 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） §3-1 高效液相色谱法的特点
HPLC与GC差别 1.分析对象的区别 GC:适于能气化、沸点较低、热稳定性好的 样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差 离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样 品不可检测。 占有机物的20%（能测定） HPLC:不受样品挥发性和热稳定性的限制， 对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品 及高分子和离子型样品均可检测。 用途广泛，占有机物的80%
一 、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、沸点较低、热稳定性好的 样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样 品不可检测。 占有机物的20%（能测定） HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制， 对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品 及高分子和离子型样品均可检测。 用途广泛，占有机物的80%
2. 流动相作用的区别 GC:流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 PLC:流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作 用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性 和H值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种 或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3.操作条件主要差别 GC:加温操作 HPLC:室温；高压（液体粘度大）
2．流动相作用的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作 用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性 和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种 或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3．操作条件主要差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大）
高效液相色谱仪流程图 压 贮液器 1. 贮液罐 : 试，样 输 2.高压泵 (输液泵) 高压泵 进样器 3.进样装置 系 统 4.色谱柱—分离 梯度洗脱 色 5.检测器 分析 ! 6. 废液出口或组分收集器 装 ●： 柱 7.记录装置 组分 记录仪 检测器 收集器 数据处理机 图194高效液相色谱仪结构方块图
1．贮液罐 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置 二、高效液相色谱仪流程图
液相色谱 气相色谱 弱溶剂 低温 强溶剂 高温 中强溶剂 中湿 梯崖洗脱 程序升温 LiA只 保留时间一 LC梯度洗脱与GC程序升温的比较
§3-2基本理论和条件选择 基本概念与气相色谱一致，如保留值、分配系数、分离度等 基础 塔板理论一一平衡理论 理论 速率理论 范第姆特方程 也与气相色谱相同。 一、 塔板理论 与GC相同。 二、速率理论 GC:H=A+B/u+C.u (填充柱》 或H=B/u+C·u(毛细管柱) PLC:H=A+C·u(u大于05cm/s,忽略纵向扩散项
§3-2 基本理论和条件选择 基础 理论 塔板理论——平衡理论 速率理论——范第姆特方程 也与气相色谱相同。 一、塔板理论 与GC相同。 二、速率理论 基本概念与气相色谱一致，如保留值、分配系数、分离度等 GC：H = A+ B/ u +C u （填充柱） 或 H = B/ u +C u （毛细管柱） HPLC：H = A+Cu （u大于0.5cm/s,忽略纵向扩散项）
讨论：（与GC对比） 1)涡流扩散项（与GC相同） A=22·dp Ac元·dp ↓，d加三A三H↓，n↑三柱效个 2)纵向扩散项 分子在液体中的扩散系数比在气体中要小45个数量级， u大于0.5cm/s,忽略纵向扩散项 'B=2y.Dm OC- Dm很小，B相忽略 m
2）纵向扩散项 B Dm = 2 T Dm Dm很小，B相忽略 ➢ 讨论： （与GC对比） 1）涡流扩散项 (与GC相同) A = 2 dp A dp ，dp A H ，n 柱效 分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4-5个数量级， u大于0.5cm/s,忽略纵向扩散项
3)传质阻力项c.u C=Cm+Csm+Cs dp? T D 7 C; dp三C↓→H↓，n个→柱效↑，因此减小粒度 是提高柱效的最有效途径：选用低黏度的流动相，或 适当提高柱温以降低流动相黏度，都有利提高传质
3）传质阻力项c.u C = Cm +Csm +Cs m m sm D dp C C 2 、 T Dm 适当提高柱温以降低流动相黏度，都有利提高传质。 是提高柱效的最有效途径 选用低黏度的流动相，或 ， 柱效 ，因此减小粒度 ; dp C H n s s D df C 2
A B 原如谱带 工克度 T最后 诺带 10 千始 祸流扩散 ! 流动相传质 停滑流动相传质 固定相传质 C D E