D01:10.13374.isml001053x.2007.s2.56 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 SuppL 2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dec.2007 一株耐盐芽孢杆菌的分离与鉴定 周钰钢魏巍 北京科技大学应用科学学院北京100083 摘要从校园草坪土壤中分离得到一株能够在20%NC1的高盐条件下生长的耐盐细菌.经过形态观察、生理特征分析及 16 SrDNA序列分析，鉴定为一株芽孢杆菌(Bacillus sp.,并在GenBank中完成该菌株16 SrDNA序列的注册，登录号为 EU167738. 关键词耐盐；芽孢杆菌：鉴定 分类号Q9391 面对日益严重的土壤盐渍化现象，分离耐盐基 培养2天观察菌落形态，并挑取少量菌体采用 因，构建转基因耐盐植物，开发利用盐碱地是世界各 Olympus CX71光学显微镜进行革兰氏染色观察. 国密切关注的研究方向刂.耐盐菌，也称为兼性嗜 1.3生理特征分析 盐菌(Facultative halophiles),能够在有盐环境和无 (1)生长曲线测定.采用普通牛肉膏蛋白胨液 盐环境中生长繁殖，耐盐度最高可达20%，它最主 体培养基在30℃和37℃下200rmim1振荡培养， 要的特点是兼性嗜盐，能生存的环境范围广，是耐盐 测560m处0D值，24h测一次. 基因的丰富来源？.虽然生长在极端环境下的一些 (2)耐盐性分析.配制含NaCl浓度为0.5% 极端嗜盐菌耐盐度较高，但在低盐或无盐条件下却 5%,10%,15%,20%,25%的牛肉膏蛋白胨固体培 不能生长.所以，从普通环境下分离得到的耐盐菌 养基，划线培养30℃下培养3天.观察生长情况， 应该具有更普遍的生物学意义到.本研究从北科大 以确定细菌耐盐程度. 校园草坪收集土样，采用含盐的肉膏蛋白胨培养基 (3)耐酸碱性分析.采用pH值分别为4,5,6 分离出一株耐盐细菌，并进行了细菌形态观察、生理 7,8,9,10,11普通牛肉膏蛋白胨液体培养基，30 分析及16 SrDNA核酸序列等分析，为今后耐盐基因 ℃，200r°min-1振荡培养，测560nm处0D值，24h 的克隆及转基因耐盐植株的构建奠定了一定的基 测一次，确定细菌的耐酸碱性 础. (4)抗生素敏感性分析.配制含NaCl浓度为 1材料与方法 0.5%5%,10%的牛肉膏蛋白胨固体培养基，测在 不同盐浓度下对抗生素的敏感性.抗生素的种类及 11菌株的分离与培养 工作浓度为：四环素(Tet)12gmL;链霉素(Str) 取土样1g,悬浮于100mL无菌水中，从中取1 100gmL；卡那霉素(Ka)30g°mL';氨苄青霉 mL加入9mL无菌水，此为稀释10倍.以此类推稀 素(Amp)100g°mL;氯霉素(Cm)20gmL: 释至105倍.配NaC浓度为05%，1%，5%，10% 壮观霉素(Spe)l00gmL';庆大霉素(Gen)15g 15%的牛肉膏蛋白胨固体培养基并灭菌，用移液器 mL;红霉素(Er5gmL. 分别取土壤稀释液0.1mL涂布于不同盐浓度平板 1.416SDNA序列分析 上，平行三组，30℃下培养2~3天.选取在10%高 (1)基因组提取与PCR扩增.基因组提取采用 盐浓度生长良好的菌落，反复划线于I0%NaCI牛 北京天为时代公司细菌基因组提取试剂盒完成. 肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30℃培养后保存菌 PCR上游引物5一AGA GTT TGA TCA TGG CTC 种. AG-3,下游引物5-CTA CGG TTA CCT TGT 12形态观察 TAC GAC-3.PCR反应程序为：94℃变性1minm 采用牛肉膏蛋白胨培养基固体平板划线，30℃ 50C退火1min,72℃延伸3min,30个循环 收稿日期：2007-09-28 (2)16SDNA序列同源性分析.扩增产物由北 作者简介：魏巍(1973一)，男，讲师，理学博士 京三博远志生物技术公司测序.序列结果通过Blast
一株耐盐芽孢杆菌的分离与鉴定 周钰钢 魏 巍 北京科技大学应用科学学院, 北京 100083 摘 要 从校园草坪土壤中分离得到一株能够在 20% NaCl 的高盐条件下生长的耐盐细菌, 经过形态观察、生理特征分析及 16SrDNA 序列分析, 鉴定为一株芽孢杆菌(Bacillus sp .), 并在 GenBank 中完成该菌株 16SrDNA 序列的注册, 登录号为 EU167738 . 关键词 耐盐;芽孢杆菌;鉴定 分类号 Q 939.1 收稿日期:2007-09-28 作者简介:魏 巍(1973—), 男, 讲师, 理学博士 面对日益严重的土壤盐渍化现象, 分离耐盐基 因,构建转基因耐盐植物 ,开发利用盐碱地是世界各 国密切关注的研究方向[ 1] .耐盐菌, 也称为兼性嗜 盐菌(Facultative halophiles), 能够在有盐环境和无 盐环境中生长繁殖 , 耐盐度最高可达 20 %, 它最主 要的特点是兼性嗜盐 ,能生存的环境范围广, 是耐盐 基因的丰富来源 [ 2] .虽然生长在极端环境下的一些 极端嗜盐菌耐盐度较高, 但在低盐或无盐条件下却 不能生长.所以, 从普通环境下分离得到的耐盐菌 应该具有更普遍的生物学意义[ 3] .本研究从北科大 校园草坪收集土样 ,采用含盐的肉膏蛋白胨培养基 分离出一株耐盐细菌 ,并进行了细菌形态观察 、生理 分析及 16SrDNA 核酸序列等分析 ,为今后耐盐基因 的克隆及转基因耐盐植株的构建奠定了一定的基 础. 1 材料与方法 1.1 菌株的分离与培养 取土样 1g ,悬浮于 100 mL 无菌水中, 从中取 1 mL 加入9 mL 无菌水,此为稀释 10 倍.以此类推稀 释至 10 5 倍 .配 NaCl 浓度为 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %的牛肉膏蛋白胨固体培养基并灭菌, 用移液器 分别取土壤稀释液 0.1 mL 涂布于不同盐浓度平板 上,平行三组, 30 ℃下培养 2 ～ 3 天.选取在 10 %高 盐浓度生长良好的菌落, 反复划线于 10 % NaCl 牛 肉膏蛋白胨固体培养基平板上 , 30 ℃培养后保存菌 种. 1.2 形态观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基固体平板划线 , 30 ℃ 培养 2 天观察菌落形态 , 并挑取少量菌体采用 Olympus CX71 光学显微镜进行革兰氏染色观察 . 1.3 生理特征分析 (1)生长曲线测定.采用普通牛肉膏蛋白胨液 体培养基在 30 ℃和 37 ℃下 200 r·min -1振荡培养, 测 560 nm 处 OD 值 , 24 h 测一次 . (2)耐盐性分析 .配制含 NaCl 浓度为 0.5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %的牛肉膏蛋白胨固体培 养基 , 划线培养, 30 ℃下培养 3 天, 观察生长情况, 以确定细菌耐盐程度. (3)耐酸碱性分析.采用 pH 值分别为 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 普通牛肉膏蛋白胨液体培养基 , 30 ℃, 200 r·min -1振荡培养, 测 560 nm 处 OD 值 , 24 h 测一次 ,确定细菌的耐酸碱性. (4)抗生素敏感性分析 .配制含 NaCl 浓度为 0.5 %, 5 %, 10 %的牛肉膏蛋白胨固体培养基 ,测在 不同盐浓度下对抗生素的敏感性.抗生素的种类及 工作浓度为:四环素(Tet)12 μg·mL -1 ;链霉素(Str) 100μg·mL -1 ;卡那霉素(Ka)30 μg·mL -1 ;氨苄青霉 素(Amp)100 μg·mL -1 ;氯霉素(Cm)20 μg·mL -1 ; 壮观霉素(Spe)100 μg·mL -1 ;庆大霉素(Gen)15 μg· mL -1 ;红霉素(Er)5 μg·mL -1 . 1.4 16SrDNA序列分析 (1)基因组提取与 PCR 扩增 .基因组提取采用 北京天为时代公司细菌基因组提取试剂盒完成. PCR 上游引物 5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′, 下游引物 5′-CTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC-3′.PCR 反应程序为:94 ℃变性 1 min , 50 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸 3 min , 30 个循环. (2)16SrDNA 序列同源性分析.扩增产物由北 京三博远志生物技术公司测序.序列结果通过 Blast 第 29 卷 增刊 2 2007 年 12 月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol.29 Suppl.2 Dec.2007 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2007.s2.056
。222 北京科技大学学报 2007年增刊2 分析比对同源性，并提交GenBank注册， 2.5抗生素敏感性分析 2结果与分析 在低盐浓度平板上，该菌株对所有测试抗生素 均敏感导致无法生长.而在10%NaCl的牛肉膏蛋 21形态观察与染色结果 白胨平板上，该菌株对Str,Gen,Ka三种抗生素表 耐盐菌的菌落颜色为淡橙色，表面湿润光滑，不 现出抗性，能够生长. 透明，革兰氏染色呈阳性， 2.616SDNA序列结果分析 2.2生长曲线 该菌株1SDNA的PCR扩增产物经测序表明 测培养液在560nm处的吸光值，24h测一次， 长度为1419bp,并在GenBank中完成注册，登录号为 观察其生长状况.鉴于生长后期菌液浓度较高，所 EU167738.该序列与GenBank中芽孢杆菌属(Bad- 以从开始均稀释8倍.结果表明30℃下生长好于 lus)的16SDNA序列同源性在97%~99%之间，确定 37℃如图1. 是一种芽孢杆菌本3，命名为Bacillus sp.O71l. 0.7r 0.6 3讨论 0.5 0.4 8 0.3 耐盐菌是世界上备受重视的具有重要开发价值 0.2 *…30℃ 0.1 。-37℃ 的微生物资源，耐盐菌的基因与耐盐机制的研究，无 20 40 80 论对转基因抗盐植株构建、农业生产、环境修复，还 时间h 是对工业废水处理及石油污染整治等方面均有着广 图1耐盐菌生长曲线 阔的应用前景到，本研究从普通环境下分离得到高 2.3耐盐性分析 度耐盐的芽孢杆菌，具有普遍的生物学意义和应用 本研究发现该菌株可在05%~20%NaC1范 价值.研究中我们发现高浓度盐可诱导Bacillus 围内生长，最高耐盐浓度为20%NaCl,在25%NaCl sp.O71菌株出现对氨基糖苷类抗生素的抗药性，进 一步研究抗药性产生的原因，无疑对研究细菌在盐 的平板上无法生长 2.4耐酸碱性分析 胁迫环境下的响应机制及信号转导等基础研究提供 从表1中可以看出，该耐盐菌最适生长pH值范 了一个新的角度和思路 围在8~10之间，在pH值9左右生长最好，在H值 参考文献 7以下不生长.说明该菌株耐盐的同时也耐碱. 【刂杨松杰，张富春，刘世贵。盐渍化土壤改良利用新方法.世界 林业研究200619(1)：14 表1耐盐菌的耐酸碱性分析 【习李尔场，程洁红。史乐文等.耐盐菌的研究.江苏石油化工学 时间/hpH4H5H6pH7pH8pH9pH10pHI1 院学报.2001,13(4)：4 0 0.01200120.0120.0120.0120.0120.0120.012 [3 Ventosa A.Marquez M C.Garabito M J.Moderately halophilic Gram-positive bacterial diversity in hypersaline eironments Ex 240.01200130.0160.0150.5930.6230.4550.015 tremophiles 1998 2:297 480.01800160.0160.0160.4390.4900.5720.019 【4雷正瑜.1 SrDN A序列分析技术在微生物分类鉴定中的应 用.湖北生态工程职业技术学院学报.20064(1：4 720.02100200.0200.0190.4700.3420.2470.017 【习张会敏，冯友军.一株野生细菌的1⑥rDNA序列分析与系统 发有树的构建.生物信息学，20043(1)：1 Isolation and identification of a strain of salt-tolerant Bacillus sp. ZHOU Yugang,WEI Wei Appled Science School University of Science and Technology Beijing.Biing 100083.China ABSTRACT A strain of salt-tolerant bacteria was isolated from the soil of campus law n and the salt tolerance of the strain was up to 20%NaCl.The results of the analysis of morphology,physiolgical characteristics and 16SrDNA sequence showed that the strain was a bacterium of the genus of Bacillus.The 16SrDNA sequence w as registered in GenBank and the accession number w as EUl67738. KEY WORDS salt-tolerant;Bacillus;identificat ion
分析比对同源性 ,并提交 GenBank 注册 . 2 结果与分析 2.1 形态观察与染色结果 耐盐菌的菌落颜色为淡橙色, 表面湿润光滑, 不 透明 ,革兰氏染色呈阳性 . 2.2 生长曲线 测培养液在 560 nm 处的吸光值 , 24 h 测一次 , 观察其生长状况.鉴于生长后期菌液浓度较高 , 所 以从开始均稀释 8 倍.结果表明 30 ℃下生长好于 37 ℃, 如图 1 . 图 1 耐盐菌生长曲线 2.3 耐盐性分析 本研究发现该菌株可在 0.5 %～ 20 % NaCl 范 围内生长 ,最高耐盐浓度为 20 %NaCl ,在 25 %NaCl 的平板上无法生长. 2.4 耐酸碱性分析 从表 1 中可以看出, 该耐盐菌最适生长 pH 值范 围在8 ～ 10 之间 ,在 pH 值 9 左右生长最好, 在 pH 值 7 以下不生长.说明该菌株耐盐的同时也耐碱. 表 1 耐盐菌的耐酸碱性分析 时间/ h pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 pH11 0 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 24 0.012 0.013 0.016 0.015 0.593 0.623 0.455 0.015 48 0.018 0.016 0.016 0.016 0.439 0.490 0.572 0.019 72 0.021 0.020 0.020 0.019 0.470 0.342 0.247 0.017 2.5 抗生素敏感性分析 在低盐浓度平板上 ,该菌株对所有测试抗生素 均敏感导致无法生长.而在 10 %NaCl 的牛肉膏蛋 白胨平板上, 该菌株对 Str , Gen , Ka 三种抗生素表 现出抗性,能够生长. 2.6 16SrDNA序列结果分析 该菌株 16SrDNA 的 PCR 扩增产物经测序表明 长度为 1 419bp ,并在 GenBank 中完成注册,登录号为 EU167738 .该序列与 GenBank 中芽孢杆菌属(Bacillus)的16SrDNA 序列同源性在 97 %～ 99 %之间,确定 是一种芽孢杆菌[ 4-5] ,命名为 Bacillus sp .071 . 3 讨论 耐盐菌是世界上备受重视的具有重要开发价值 的微生物资源,耐盐菌的基因与耐盐机制的研究 ,无 论对转基因抗盐植株构建 、农业生产 、环境修复, 还 是对工业废水处理及石油污染整治等方面均有着广 阔的应用前景[ 3] .本研究从普通环境下分离得到高 度耐盐的芽孢杆菌, 具有普遍的生物学意义和应用 价值 .研究中我们发现高浓度盐可诱导 Bacillus sp .071 菌株出现对氨基糖苷类抗生素的抗药性 ,进 一步研究抗药性产生的原因 ,无疑对研究细菌在盐 胁迫环境下的响应机制及信号转导等基础研究提供 了一个新的角度和思路 . 参 考 文 献 [ 1] 杨松杰, 张富春, 刘世贵.盐渍化土壤改良利用新方法.世界 林业研究, 2006 , 19(1):14 [ 2] 李尔炀, 程洁红, 史乐文, 等.耐盐菌的研究.江苏石油化工学 院学报, 2001 , 13(4):4 [ 3] Ventosa A, Marquez M C , Garabito M J.Moderat ely halophilic Gram-positive bacterial diversity in hypersaline environm ents.Extremophiles, 1998 , 2:297 [ 4] 雷正瑜.16S rDNA 序列分析技术在微生物分类鉴定中的应 用.湖北生态工程职业技术学院学报, 2006 , 4(1):4 [ 5] 张会敏, 冯友军.一株野生细菌的 16S rDNA 序列分析与系统 发育树的构建.生物信息学, 2004 , 3(1):1 Isolation and identification of a strain of salt-tolerant Bacillus sp . ZHOU Y ugang , WEI Wei Applied S cience School, University of Science and T echnology Beijing , Beijing 100083 , China ABSTRACT A strain of salt-tolerant bacteria w as isolated from the soil of campus law n and the salt tolerance of the strain w as up to 20 % NaCl .The results of the analysis of morphology , physiological characteristics and 16SrDNA sequence showed that the strain w as a bacterium of the genus of Bacillus .The 16SrDNA sequence w as registered in GenBank and the accession number w as EU167738 . KEY WORDS salt-tolerant ;Bacillus ;identification · 222 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2