实验十二 食品中亚硝酸盐含量测定 （格里斯试剂比色法） （—）目的 熟悉食品中亚硝酸盐的卫生标准，掌握食品中亚硝酸盐含量测定的基本方 法。 （二）原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸 重氮化后，在与 N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料后，与标准比较定量。 （三）试剂 实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。 1．氯化胺缓冲液 lL 容量瓶中加入 500ml 水，准确加人 20.0ml 盐酸，振荡 混匀，准确加入 50ml 氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化 铵调试至 pH9.6～9.7。 2．0.42mol／L 硫酸锌溶液 称取 120g 硫酸锌（ZnSO4·7H20），用水溶解 并稀释至 1000ml。 3. 20g／L 氢氧化钠溶液 称取 20g 氢氧化钠用水溶解，稀释至 1L。 4. 对氨基苯磺酸溶液 称取 10g 对氨基苯磺酸，溶于 700ml 水和 300ml 冰 乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。 5. 0.1％N－1－萘基乙二胺溶液 称取 0.lg N－1－荼基乙二胺，加 60％乙酸 溶解并稀释至 100ml，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 6. 显色剂 临用前将 0.1％N－1－萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液等 体积混合。 7. 亚硝酸钠标准溶液 准确称取 250.0mg 于硅胶干燥器中干燥 24h 的亚硝 酸钠，加水溶解移入 500ml 容量瓶中，加 100ml 氯化胺缓冲液，加水稀释至刻 度，混匀，在 4℃避光保存。此溶液每毫升相当于 500ug 的亚硝酸钠。 8．亚硝酸钠标准使用液 临用前，吸取亚硝酸钠标淮溶液 1.00ml，置于 100ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于 5.0ug 亚硝酸钠。 （四）仪器 1．小型粉碎机
实验十二 食品中亚硝酸盐含量测定 （格里斯试剂比色法） （—）目的 熟悉食品中亚硝酸盐的卫生标准，掌握食品中亚硝酸盐含量测定的基本方 法。 （二）原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸 重氮化后，在与 N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料后，与标准比较定量。 （三）试剂 实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。 1．氯化胺缓冲液 lL 容量瓶中加入 500ml 水，准确加人 20.0ml 盐酸，振荡 混匀，准确加入 50ml 氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化 铵调试至 pH9.6～9.7。 2．0.42mol／L 硫酸锌溶液 称取 120g 硫酸锌（ZnSO4·7H20），用水溶解 并稀释至 1000ml。 3. 20g／L 氢氧化钠溶液 称取 20g 氢氧化钠用水溶解，稀释至 1L。 4. 对氨基苯磺酸溶液 称取 10g 对氨基苯磺酸，溶于 700ml 水和 300ml 冰 乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。 5. 0.1％N－1－萘基乙二胺溶液 称取 0.lg N－1－荼基乙二胺，加 60％乙酸 溶解并稀释至 100ml，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 6. 显色剂 临用前将 0.1％N－1－萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液等 体积混合。 7. 亚硝酸钠标准溶液 准确称取 250.0mg 于硅胶干燥器中干燥 24h 的亚硝 酸钠，加水溶解移入 500ml 容量瓶中，加 100ml 氯化胺缓冲液，加水稀释至刻 度，混匀，在 4℃避光保存。此溶液每毫升相当于 500ug 的亚硝酸钠。 8．亚硝酸钠标准使用液 临用前，吸取亚硝酸钠标淮溶液 1.00ml，置于 100ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于 5.0ug 亚硝酸钠。 （四）仪器 1．小型粉碎机
2．分光光度计 （五）操作方法 1．样品处理 称取约 10.00g（粮食取 5g）经绞碎混匀样品，置于打碎机中， 加 70ml 水和 12m1 2％氢氧化钠溶液，混匀，用 2％氢氧化钠溶液调样品至 pH8， 定量转移至 200ml 容量瓶中加 10ml 硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再 补加 2～5m1 氢氧化钠，混匀。置 60℃水浴中加热 10min，取出后冷至室温，加 水至刻度，混匀。放置 0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液 20m1，收集滤液备用。 2. 亚硝酸盐标准曲线的制备 吸取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 亚硝 酸钠标准使用液（相当于 0，2.5，5，10，15，20，25ug 亚硝酸钠），分别置于 25ml 带塞比色管中。于标准管中分别加入 4.5ml 氯化胺缓冲液，加 2.5m1 60％ 乙酸后立即加入 5.0ml 显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置 25min，用 1cm 比色杯（灵敏度低时可换 2cm 比色杯），以零管调零点，于波长 550nm 处测吸光 度，绘制标准曲线。 低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：吸取 0，0.4，0.8， 1.2，1.6，2.0ml 亚硝酸钠标准使用液（分别相当于 0，2，4，6，8，10ug 亚硝酸 钠）。 3. 样品测定：吸取 10.0ml 上述滤液（样品处理滤液）于 25ml 带塞比色管 中，其它操作同上。 （六）结果计算
2．分光光度计 （五）操作方法 1．样品处理 称取约 10.00g（粮食取 5g）经绞碎混匀样品，置于打碎机中， 加 70ml 水和 12m1 2％氢氧化钠溶液，混匀，用 2％氢氧化钠溶液调样品至 pH8， 定量转移至 200ml 容量瓶中加 10ml 硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再 补加 2～5m1 氢氧化钠，混匀。置 60℃水浴中加热 10min，取出后冷至室温，加 水至刻度，混匀。放置 0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液 20m1，收集滤液备用。 2. 亚硝酸盐标准曲线的制备 吸取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 亚硝 酸钠标准使用液（相当于 0，2.5，5，10，15，20，25ug 亚硝酸钠），分别置于 25ml 带塞比色管中。于标准管中分别加入 4.5ml 氯化胺缓冲液，加 2.5m1 60％ 乙酸后立即加入 5.0ml 显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置 25min，用 1cm 比色杯（灵敏度低时可换 2cm 比色杯），以零管调零点，于波长 550nm 处测吸光 度，绘制标准曲线。 低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：吸取 0，0.4，0.8， 1.2，1.6，2.0ml 亚硝酸钠标准使用液（分别相当于 0，2，4，6，8，10ug 亚硝酸 钠）。 3. 样品测定：吸取 10.0ml 上述滤液（样品处理滤液）于 25ml 带塞比色管 中，其它操作同上。 （六）结果计算