实验五 食物中核黄素含量测定 （荧光法） （－）目的意义 核黄素是机体的物质代谢和能量代谢中不可缺少的物质。通过测定食物中核 黄素含量，可了解人体核黄素摄入情况。 （二）原理 核黄素受到波长为 440～500nm 的光照射后能产生光黄素（luniflavin），此 物质能产生较强的荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素浓度成正比。 试液中再加人低亚硫酸钠（Na2S2O4），将荧光素还原为无荧光物质。然后再 测定试液中残余荧光物质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光 强度。 （三）仪器与试剂 1．荧光光度计 2．高压消毒锅 3．锥形烧瓶，核黄素吸附柱（如图 6－1） 4. 1.0mol／L 盐酸溶液 吸取分析纯浓盐酸 83.3ml 于 1L 容量瓶中，加蒸馏 水稀释至刻度。 5. 0.lmol／L 盐酸溶液 将上液按 1：10 稀释。 6．4％氢氧化钠溶液，0.4％氢氧化钠溶液。 7．3％高锰酸钾溶液。 8．3％过氧化氢溶液。 9．核黄素储备液（23ug／ml） 精确称取已干燥过的核黄素（在干燥器中放 置 24h）25mg，加少量蒸馏水溶解后倒入 1L 容量瓶，加蒸馏水 500ml，加入 2.4ml 冰醋酸，将其放在温水中摇动使颗粒完全溶解，冷却后稀释至刻度，加入少量甲 苯，避光冷藏备用。 10. 核黄素工作液（0.lug／ml） 吸取上液 1.0ml，加水稀释至 250ml。避光， 贮于 4℃冰箱中可保存 1 周。 11．20％低亚硫酸钠溶液 用时现配，保存在冰水浴中，4h 内有效。 12. 0.04％溴甲酚绿指示剂 称取 0.1g 溴甲酚绿于小研钵中，加 1.4m1 0.4％
实验五 食物中核黄素含量测定 （荧光法） （－）目的意义 核黄素是机体的物质代谢和能量代谢中不可缺少的物质。通过测定食物中核 黄素含量，可了解人体核黄素摄入情况。 （二）原理 核黄素受到波长为 440～500nm 的光照射后能产生光黄素（luniflavin），此 物质能产生较强的荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素浓度成正比。 试液中再加人低亚硫酸钠（Na2S2O4），将荧光素还原为无荧光物质。然后再 测定试液中残余荧光物质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光 强度。 （三）仪器与试剂 1．荧光光度计 2．高压消毒锅 3．锥形烧瓶，核黄素吸附柱（如图 6－1） 4. 1.0mol／L 盐酸溶液 吸取分析纯浓盐酸 83.3ml 于 1L 容量瓶中，加蒸馏 水稀释至刻度。 5. 0.lmol／L 盐酸溶液 将上液按 1：10 稀释。 6．4％氢氧化钠溶液，0.4％氢氧化钠溶液。 7．3％高锰酸钾溶液。 8．3％过氧化氢溶液。 9．核黄素储备液（23ug／ml） 精确称取已干燥过的核黄素（在干燥器中放 置 24h）25mg，加少量蒸馏水溶解后倒入 1L 容量瓶，加蒸馏水 500ml，加入 2.4ml 冰醋酸，将其放在温水中摇动使颗粒完全溶解，冷却后稀释至刻度，加入少量甲 苯，避光冷藏备用。 10. 核黄素工作液（0.lug／ml） 吸取上液 1.0ml，加水稀释至 250ml。避光， 贮于 4℃冰箱中可保存 1 周。 11．20％低亚硫酸钠溶液 用时现配，保存在冰水浴中，4h 内有效。 12. 0.04％溴甲酚绿指示剂 称取 0.1g 溴甲酚绿于小研钵中，加 1.4m1 0.4％
氢氧化钠溶液研磨，加少许水继续研磨直至完全溶解，加水稀释至 250ml。 13. 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液 使用时现配制。 14．10％木瓜蛋白酶溶液 使用前用 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液配制。 15．10％淀粉酶溶液 使用前用 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液配制。 16. 洗脱液 丙酮：冰酷酸：水（5：2：9）。 （四）操作步骤 整个操作过程需避光进行。 1．样品前处理 称取 2～10g 样品（约含 10～200ug 核黄素）于 100ml 锥形 瓶中，加人 50m1 0.1mol／L 盐酸，搅拌使样品颗粒分散均匀后，置于高压锅内， 在 10.3×104Pa 高压下水解样品 30min。水解液冷却后，加人 4％氢氧化钠调 pH 至 4.5（取少许水解液用溴甲酚绿检验呈草绿色，pH 即为 4.5）。 2．酶解
氢氧化钠溶液研磨，加少许水继续研磨直至完全溶解，加水稀释至 250ml。 13. 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液 使用时现配制。 14．10％木瓜蛋白酶溶液 使用前用 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液配制。 15．10％淀粉酶溶液 使用前用 2.5mol／L 无水乙酸钠溶液配制。 16. 洗脱液 丙酮：冰酷酸：水（5：2：9）。 （四）操作步骤 整个操作过程需避光进行。 1．样品前处理 称取 2～10g 样品（约含 10～200ug 核黄素）于 100ml 锥形 瓶中，加人 50m1 0.1mol／L 盐酸，搅拌使样品颗粒分散均匀后，置于高压锅内， 在 10.3×104Pa 高压下水解样品 30min。水解液冷却后，加人 4％氢氧化钠调 pH 至 4.5（取少许水解液用溴甲酚绿检验呈草绿色，pH 即为 4.5）。 2．酶解
（1）含有淀粉样品的水解液加入 3ml 10％淀粉酶溶液，于 37～40℃保温约 16h。 （2）含有高蛋白样品的水解液加人 3ml 10％木瓜蛋白酶溶液，于 37～40℃保 温约 16h。 上述酶水解液用蒸馏水定容至 100ml，过滤。滤液在 4℃冰箱可保存 1 周。 3．氧化去杂质 取试管 2 支分别编号 A 和 B，按表 6－1 操作。 混匀后放置 2min 以氧化样品中的杂质与色素，再滴加 3％过氧化氢至溶液 褪色，以还原高锰酸钾。剧烈摇动试管，使多余氧气逸出。 4．核黄素的吸附与洗脱 吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，然后称取 1g 硅镁吸附剂湿法装柱（约 5cm 高）。勿使柱内产生气泡，调节流速为 60 滴／分 钟左右。将 A 和 B 管内氧化后的液体通过吸附柱后，用约 20ml 热蒸馏水洗脱样 品中的杂质，再用 5.0ml 洗脱液将核黄素洗脱，用具塞试管收集洗脱液，再用蒸 馏水洗脱吸附柱，收集洗出的液体合并于具塞试管中，定容至 10ml，混匀后留 待测荧光强度。 5.测定荧光强度 选择激发波长为 420nm，发射波长为 520nm，测定样品管 及标准管的荧光强度。然后，在各管的剩余液中加 0.1m1 20％低亚硫酸钠溶液， 立即混匀，在 20s 内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。 （五）结果计算
（1）含有淀粉样品的水解液加入 3ml 10％淀粉酶溶液，于 37～40℃保温约 16h。 （2）含有高蛋白样品的水解液加人 3ml 10％木瓜蛋白酶溶液，于 37～40℃保 温约 16h。 上述酶水解液用蒸馏水定容至 100ml，过滤。滤液在 4℃冰箱可保存 1 周。 3．氧化去杂质 取试管 2 支分别编号 A 和 B，按表 6－1 操作。 混匀后放置 2min 以氧化样品中的杂质与色素，再滴加 3％过氧化氢至溶液 褪色，以还原高锰酸钾。剧烈摇动试管，使多余氧气逸出。 4．核黄素的吸附与洗脱 吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，然后称取 1g 硅镁吸附剂湿法装柱（约 5cm 高）。勿使柱内产生气泡，调节流速为 60 滴／分 钟左右。将 A 和 B 管内氧化后的液体通过吸附柱后，用约 20ml 热蒸馏水洗脱样 品中的杂质，再用 5.0ml 洗脱液将核黄素洗脱，用具塞试管收集洗脱液，再用蒸 馏水洗脱吸附柱，收集洗出的液体合并于具塞试管中，定容至 10ml，混匀后留 待测荧光强度。 5.测定荧光强度 选择激发波长为 420nm，发射波长为 520nm，测定样品管 及标准管的荧光强度。然后，在各管的剩余液中加 0.1m1 20％低亚硫酸钠溶液， 立即混匀，在 20s 内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。 （五）结果计算
F—稀释倍数 W—样品重量，g S—标准管中核黄素含量；ug （六）结果说明 1. 加入低亚硫酸钠的量不能过多以免影响荧光强度，加入后必须立即读数， 否则核黄素又会被空气氧化为荧光型。 2．过氧化氢不宜多加，因会产生气泡而影响比色。 3．如加入高锰酸钾后有氧化锰细微褐色溶液混浊，可离心使之澄清。 4. 不能用皂粉洗涤玻璃器材，应用硫酸—重铬酸钾洗液浸洗，再以清水洗 净，继以蒸馏水冲洗
F—稀释倍数 W—样品重量，g S—标准管中核黄素含量；ug （六）结果说明 1. 加入低亚硫酸钠的量不能过多以免影响荧光强度，加入后必须立即读数， 否则核黄素又会被空气氧化为荧光型。 2．过氧化氢不宜多加，因会产生气泡而影响比色。 3．如加入高锰酸钾后有氧化锰细微褐色溶液混浊，可离心使之澄清。 4. 不能用皂粉洗涤玻璃器材，应用硫酸—重铬酸钾洗液浸洗，再以清水洗 净，继以蒸馏水冲洗