实验九 食品中总黄酮的测定 （－）目的意义 黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多 以苷类形式存在。其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成 分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。通过本方法的学习， 可以掌握食物中总黄酮的测定方法。 （二）高效液相色谱法 1. 原理 植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相 色谱法分离，在紫外检测器 360nm 条件下，以保留时间定性、峰面积定量。 2．仪器和试剂 （1）高效液相色谱仪 （2）紫外检测器 （3）层析柱 （4）超声波清洗仪 （5）索氏提取器 （6）微孔过滤器（滤膜 0.45um） （7）甲醇（色谱纯） （8）芦丁标准品 （9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。 （10）去离子水 （11）芦丁标准溶液：精确称取经 105℃干燥恒重的芦丁标谁品 15.0mg，加甲 醇溶解并定容至 100ml，配成 150ug／ml 的芦丁标准溶液。 3. 操作步骤 （1）样品处理 1）固体样品：称取 2.0g 干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石 油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油 醚，加人甲醇 50ml 和 25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解 1h，取出后快速冷却至 室温，转移至 50ml 容量瓶中，甲醇定容，经 0.45um 滤膜过滤，供分析用
实验九 食品中总黄酮的测定 （－）目的意义 黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多 以苷类形式存在。其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成 分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。通过本方法的学习， 可以掌握食物中总黄酮的测定方法。 （二）高效液相色谱法 1. 原理 植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相 色谱法分离，在紫外检测器 360nm 条件下，以保留时间定性、峰面积定量。 2．仪器和试剂 （1）高效液相色谱仪 （2）紫外检测器 （3）层析柱 （4）超声波清洗仪 （5）索氏提取器 （6）微孔过滤器（滤膜 0.45um） （7）甲醇（色谱纯） （8）芦丁标准品 （9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。 （10）去离子水 （11）芦丁标准溶液：精确称取经 105℃干燥恒重的芦丁标谁品 15.0mg，加甲 醇溶解并定容至 100ml，配成 150ug／ml 的芦丁标准溶液。 3. 操作步骤 （1）样品处理 1）固体样品：称取 2.0g 干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石 油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油 醚，加人甲醇 50ml 和 25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解 1h，取出后快速冷却至 室温，转移至 50ml 容量瓶中，甲醇定容，经 0.45um 滤膜过滤，供分析用
2）液体样品：准确吸取样品 2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后， 以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。 （2）色谱分离条件 色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um; 流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气； 流 速：lml／min； 柱 温：40℃； 检测波长：360nm； 灵敏度：0.02AUFS； 进样量：20ul。 （3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各 10ul，注入高液相色谱仪进 行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含 量。 4．结果计算 （三）分光光度法 1．原理 黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称， 一般都具有 4 位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的 3—羟基、4—羟基或 5—羟 基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的 络合物
2）液体样品：准确吸取样品 2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后， 以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。 （2）色谱分离条件 色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um; 流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气； 流 速：lml／min； 柱 温：40℃； 检测波长：360nm； 灵敏度：0.02AUFS； 进样量：20ul。 （3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各 10ul，注入高液相色谱仪进 行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含 量。 4．结果计算 （三）分光光度法 1．原理 黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称， 一般都具有 4 位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的 3—羟基、4—羟基或 5—羟 基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的 络合物
本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于 510nm 波 长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。 2．仪器和试剂 （1）722 分光光度计 （2）索氏提取器 （3）真空泵，盐基交换管等。 （4）恒温水浴，分液漏斗。 （5）芦丁标准品 （6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。 （7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。 （8）5％香草醛溶液：称取 5g 香草醛，加冰乙酸溶解并定容至 100ml。 （9）聚酰胺树脂 （10）去离子水 （11）同前 3．操作步骤 （1）样品处理 1）固体样品：称取 1～2g 干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器 中，加入 50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在 80℃水浴下回流 3h，至提取液无 色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量 25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤 液。在 50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。 倒出容器内溶液，用 30ml 热水分 3 次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中， 以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至 50ml。 称取 1～2g 经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱 脂后的水溶液 1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分 吸附后，用 70％乙醇或甲醇洗脱，流速为 1.0ml／min，至流出液基本无色，一 般收集 10ml 即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。 2）液体样品：准确吸取 1.0ml 样品，定容至 50ml 后，直接以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，其余步骤同上。 （2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00
本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于 510nm 波 长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。 2．仪器和试剂 （1）722 分光光度计 （2）索氏提取器 （3）真空泵，盐基交换管等。 （4）恒温水浴，分液漏斗。 （5）芦丁标准品 （6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。 （7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。 （8）5％香草醛溶液：称取 5g 香草醛，加冰乙酸溶解并定容至 100ml。 （9）聚酰胺树脂 （10）去离子水 （11）同前 3．操作步骤 （1）样品处理 1）固体样品：称取 1～2g 干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器 中，加入 50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在 80℃水浴下回流 3h，至提取液无 色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量 25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤 液。在 50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。 倒出容器内溶液，用 30ml 热水分 3 次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中， 以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至 50ml。 称取 1～2g 经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱 脂后的水溶液 1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分 吸附后，用 70％乙醇或甲醇洗脱，流速为 1.0ml／min，至流出液基本无色，一 般收集 10ml 即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。 2）液体样品：准确吸取 1.0ml 样品，定容至 50ml 后，直接以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，其余步骤同上。 （2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00
⒋00ml（相当于芦丁 0、75、150、300、450、600ug），移入 10ml 刻度比色管中， 加入 30％乙醇溶液至 5ml，各加 5％亚硝酸钠溶液 0.3ml，振摇后放置 5min，加 入 10％硝酸铝溶液 0.3ml 摇匀后放置 6min，加 1.0mol／L 氢氧化钠溶液 2ml，用 30％乙醇定容至刻度。摇匀，放置 15min，于 510nm 波长处测定吸光度，以零管 为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相 关系数（r）。 （3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲 线制备操作步骤于 510nm 处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。 4.结果计算 根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下 式求出总黄酮含量： （四）说明 1．HPLC 法与分光光度法比较，HPLC 法相对干扰少，重现性好，测定结 果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、 易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。 2．样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此 样品水解后应尽快测定。 3. 随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定
⒋00ml（相当于芦丁 0、75、150、300、450、600ug），移入 10ml 刻度比色管中， 加入 30％乙醇溶液至 5ml，各加 5％亚硝酸钠溶液 0.3ml，振摇后放置 5min，加 入 10％硝酸铝溶液 0.3ml 摇匀后放置 6min，加 1.0mol／L 氢氧化钠溶液 2ml，用 30％乙醇定容至刻度。摇匀，放置 15min，于 510nm 波长处测定吸光度，以零管 为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相 关系数（r）。 （3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲 线制备操作步骤于 510nm 处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。 4.结果计算 根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下 式求出总黄酮含量： （四）说明 1．HPLC 法与分光光度法比较，HPLC 法相对干扰少，重现性好，测定结 果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、 易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。 2．样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此 样品水解后应尽快测定。 3. 随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定