实习四 食品中总抗坏血酸测定 （荧光法） （一）目的意义 食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。当食物放置时间较长或 经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸 仍有 85％左右的维生紊 C 活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。 （二）原理 样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。脱氢型抗坏血酸 与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢 型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。 （三）仪器与试剂 1. 荧光分光光度计或有 338nm 及 340nm 波长的荧光计 2. 捣碎机 3. 100ml 容量瓶，锥形瓶，具塞试管。 4. 偏磷酸一乙酸液 称取 30g 偏磷酸（HPO3），溶于 80ml冰乙酸中，加 500ml 蒸馏水混匀，稀释至 1000ml。于 4℃冰箱可保存 7～10 天。 5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液 制法同 4，只是用 0.18mol／L 硫酸代替蒸馏水。 6． 醋酸钠溶液 溶解 500g 醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至 1000ml。 7. 硼酸一醋酸钠溶液 溶解 3g 硼酸于 100ml 醋酸钠溶液中，临用前配制。 8. 邻苯二胺溶液 称取 20mg 邻苯二胺，于临用前溶解至 100ml。 9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液 称取 0.lg 百里酚蓝，加 0.02mol／L 氢氧化 钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是 10.75ml，研磨溶解后 的溶液用水稀释至 250ml。 10．活性炭的活化 加 200g 碳粉与 lL 盐酸浓溶液（1 份盐酸＋9 份水），加 热回流 1～2 小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于 110～120℃烘箱 中干燥，备用。 11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml） 精确称取 50mg 抗坏血酸，用偏磷酸— 乙酸液溶解至 50ml 容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）
实习四 食品中总抗坏血酸测定 （荧光法） （一）目的意义 食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。当食物放置时间较长或 经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸 仍有 85％左右的维生紊 C 活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。 （二）原理 样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。脱氢型抗坏血酸 与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢 型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。 （三）仪器与试剂 1. 荧光分光光度计或有 338nm 及 340nm 波长的荧光计 2. 捣碎机 3. 100ml 容量瓶，锥形瓶，具塞试管。 4. 偏磷酸一乙酸液 称取 30g 偏磷酸（HPO3），溶于 80ml冰乙酸中，加 500ml 蒸馏水混匀，稀释至 1000ml。于 4℃冰箱可保存 7～10 天。 5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液 制法同 4，只是用 0.18mol／L 硫酸代替蒸馏水。 6． 醋酸钠溶液 溶解 500g 醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至 1000ml。 7. 硼酸一醋酸钠溶液 溶解 3g 硼酸于 100ml 醋酸钠溶液中，临用前配制。 8. 邻苯二胺溶液 称取 20mg 邻苯二胺，于临用前溶解至 100ml。 9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液 称取 0.lg 百里酚蓝，加 0.02mol／L 氢氧化 钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是 10.75ml，研磨溶解后 的溶液用水稀释至 250ml。 10．活性炭的活化 加 200g 碳粉与 lL 盐酸浓溶液（1 份盐酸＋9 份水），加 热回流 1～2 小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于 110～120℃烘箱 中干燥，备用。 11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml） 精确称取 50mg 抗坏血酸，用偏磷酸— 乙酸液溶解至 50ml 容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）
12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml） 取 10ml 抗坏血酸标准液用偏磷酸 —乙酸液稀释至 100ml。定容前测试 pH，如 pH＞2．2，则选用偏磷酸—乙酸— 硫酸液稀释。 （四）操作步骤 l. 样品处理 称 100g 样品加 100ml 偏磷酸—乙酸溶液，倒入捣碎机内打成 匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度，如呈红色，立即用偏磷酸—乙酸溶液 稀释，若呈黄色或蓝色则用偏磷酸—乙酸—硫酸溶液稀释。匀浆的取样量需根据 样品中抗坏血酸的含量而定，当样品中含量在 40~100ug 之间，一般取 20g 匀浆， 用偏磷酸一乙酸或者偏磷酸一乙酸一硫酸液稀释至 100ml，过滤，滤液备用。 2．氧化处理 分别取样品滤液和抗坏血酸标标准应用液各 80ml 于 200ml 具塞锥形瓶中，加 2g 活性炭，用力振摇 1 分钟，过滤，弃去最初数毫升滤液， 分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液待测定。 3．各取 10ml 标准氧化液于 2 个 100ml 容量瓶中，分别标明“标准”及“标 准空白”。 4. 各取 10ml 样品氧化液于 2 个 100ml 容量瓶中，分别标明“样品”及“样 品空白”。 5．于 4 标准空白”及“样品空白”溶液中各加入 5ml 硼酸—乙酸钠溶液， 混合振摇 15min，用蒸馏水稀释至 100ml，在 4℃冰箱中放置 2～3h，取出备用。 6．于“样品”及“标准”溶液中各加入 5m1 50％醋酸钠溶液，用水稀释至 100ml，备用。 ⒎ 标淮曲线的制备 取上述 6．“标准”溶液（抗坏血酸含 10ug／ml）0.5、 1.0、1.5、和 2.0ml 分别置于 10ml 具塞试管中，再用水补充至 2.0ml。每一浓度 分别作两个平行样对照。 8. 取“标准空白”溶液、“样品空白”溶液及“样品”溶液各 2ml 分别置于 10ml 具塞试管中。 9. 在暗室中迅速向各管中加入 8ml 邻苯二胺溶液，振摇均匀，在室温下反 应 35min，于激发波长 338nm，发射波长 420nm 处测定荧光强度。 （五）结果计算
12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml） 取 10ml 抗坏血酸标准液用偏磷酸 —乙酸液稀释至 100ml。定容前测试 pH，如 pH＞2．2，则选用偏磷酸—乙酸— 硫酸液稀释。 （四）操作步骤 l. 样品处理 称 100g 样品加 100ml 偏磷酸—乙酸溶液，倒入捣碎机内打成 匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度，如呈红色，立即用偏磷酸—乙酸溶液 稀释，若呈黄色或蓝色则用偏磷酸—乙酸—硫酸溶液稀释。匀浆的取样量需根据 样品中抗坏血酸的含量而定，当样品中含量在 40~100ug 之间，一般取 20g 匀浆， 用偏磷酸一乙酸或者偏磷酸一乙酸一硫酸液稀释至 100ml，过滤，滤液备用。 2．氧化处理 分别取样品滤液和抗坏血酸标标准应用液各 80ml 于 200ml 具塞锥形瓶中，加 2g 活性炭，用力振摇 1 分钟，过滤，弃去最初数毫升滤液， 分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液待测定。 3．各取 10ml 标准氧化液于 2 个 100ml 容量瓶中，分别标明“标准”及“标 准空白”。 4. 各取 10ml 样品氧化液于 2 个 100ml 容量瓶中，分别标明“样品”及“样 品空白”。 5．于 4 标准空白”及“样品空白”溶液中各加入 5ml 硼酸—乙酸钠溶液， 混合振摇 15min，用蒸馏水稀释至 100ml，在 4℃冰箱中放置 2～3h，取出备用。 6．于“样品”及“标准”溶液中各加入 5m1 50％醋酸钠溶液，用水稀释至 100ml，备用。 ⒎ 标淮曲线的制备 取上述 6．“标准”溶液（抗坏血酸含 10ug／ml）0.5、 1.0、1.5、和 2.0ml 分别置于 10ml 具塞试管中，再用水补充至 2.0ml。每一浓度 分别作两个平行样对照。 8. 取“标准空白”溶液、“样品空白”溶液及“样品”溶液各 2ml 分别置于 10ml 具塞试管中。 9. 在暗室中迅速向各管中加入 8ml 邻苯二胺溶液，振摇均匀，在室温下反 应 35min，于激发波长 338nm，发射波长 420nm 处测定荧光强度。 （五）结果计算
式中：A—标准管荧光读数 B—标淮空白管荧光读数 C—样品管荧光读数 D—样品空白管荧光读数 S—标准管中抗坏血酸浓度 F—样品稀释倍数 W—取样量，g 10—荧光反应所用试样体积，ml 1／1000—将抗坏血酸的 ug 数折算为 mg 数 （六）说明 1．处理活性炭时，可取活性炭洗涤滤液少许，加数滴 5％亚铁氰化钾，若 不出现蓝色，即无 Fe3＋存在，或滴加数滴 1％硫氰化钾，若不出现红色，也证明 没有 Fe3＋存在，将活性炭滤干水分后置烘箱内烘干，冷却后置干燥箱中备用。 2. 生食物匀浆时会产生泡沫，为定容准确可加数滴异戊醇除去。 3. 百里酚蓝指示剂变色范围 pH l.2，红色；pH 2.8，黄色；pH＞4，蓝色
式中：A—标准管荧光读数 B—标淮空白管荧光读数 C—样品管荧光读数 D—样品空白管荧光读数 S—标准管中抗坏血酸浓度 F—样品稀释倍数 W—取样量，g 10—荧光反应所用试样体积，ml 1／1000—将抗坏血酸的 ug 数折算为 mg 数 （六）说明 1．处理活性炭时，可取活性炭洗涤滤液少许，加数滴 5％亚铁氰化钾，若 不出现蓝色，即无 Fe3＋存在，或滴加数滴 1％硫氰化钾，若不出现红色，也证明 没有 Fe3＋存在，将活性炭滤干水分后置烘箱内烘干，冷却后置干燥箱中备用。 2. 生食物匀浆时会产生泡沫，为定容准确可加数滴异戊醇除去。 3. 百里酚蓝指示剂变色范围 pH l.2，红色；pH 2.8，黄色；pH＞4，蓝色