第十三章 荧光分析法 Fluorescence (分子荧光法)
第十三章 荧光分析法 Fluorescence （分子荧光法）
第一节概述 一、光致发光 物质受到光的照射时，除吸收某种波 长的光之外还会发射出波长相同或比吸 收波长更长的光。 二、光致发光分为： 荧光（f|uorescence) 磷光(Phosphorescence)
第一节 概述 一、光致发光 物质受到光的照射时，除吸收某种波 长的光之外还会发射出波长相同或比吸 收波长更长的光。 二、光致发光分为： 荧光（fluorescence) 磷光(Phosphorescence)
·1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 ·1852年，Stokes对荧光产生的机理作了解释， 并提出了“荧光”。 ·1867年，首次用于分析测定。 ·1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 ·1952年，商品荧光分光光度计出现
• 1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 • 1852年，Stokes对荧光产生的机理作了解释， 并提出了“荧光”。 • 1867年，首次用于分析测定。 • 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 • 1952年，商品荧光分光光度计出现
分子荧光： 物质分子吸收光子能量而被激发，然后 从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射 出的光。 分子荧光 紫外-可见 荧光 红外、x射线 原子荧光
分子荧光： 物质分子吸收光子能量而被激发，然后 从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射 出的光。 分子荧光 紫外-可见 荧光 红外、x射线 原子荧光
荧光的特点： 定量分析 (检出限1010g/ml~10-12g/ml) 灵敏度高 。 测定下限0.1~0.001μg/mL, 比分光光度法高2~4个数量级。 相对灵敏度： 以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/LH2S0,溶液(em450nm) 为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强 度进行比较
荧光的特点： 定量分析（检出限10-10 g/ml～10-12 g/ml) 灵敏度高 • 测定下限0.1～0.001 µg/mL, 比分光光度法高2～4个数量级。 相对灵敏度: 以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/LH2SO4溶液(em 450nm） 为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强 度进行比较
选择性好 357377400 580 ⊙OAd 20 蒽 菲 蒽的激发和发射光谱 菲在360nml以上无吸收，用 365nm激发光时，菲无荧光， 400 380 可以在400nm测定蒽的荧光。 350 ·在265nm,蒽和菲均有吸收， 以此波长的光激发，在350nm 只有菲有荧光，故可测定菲。 菲和蒽的荧光光谱 (激发波长265nm)
选择性好 蒽的激发和发射光谱 菲和蒽的荧光光谱 （激发波长265 nm) 蒽 菲 •菲在360 nm以上无吸收，用 365 nm激发光时，菲无荧光， 可以在400 nm测定蒽的荧光。 •在265 nm, 蒽和菲均有吸收， 以此波长的光激发，在350nm 只有菲有荧光，故可测定菲
第二节基本原理 含有n和π电子的分子的几种能态 元兴 n 元 基态 单重态 单重态 三重态
含有n和π电子的分子的几种能态 基态 单重态 单重态 三重态 ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓ π ↑↓ ↑↓ ↑ ↑ n ↓ ↓ ↑ π* 第二节 基本原理
单重态 三重态 S2 振动弛豫 内转换 =0 =0 T 系间 跨越 =0 脚 翻 山明 S )三0 入3 荧光 外转换 磷光 振动池豫 激发 (熄灭) 图4.1荧光和磷光体系能级图
振动弛豫：非辐射跃迁形式，在溶液中， 激发态分子通过与溶剂分子的碰撞而将 部分振动能量传递给溶剂分子，其电子 则返回到同一电子激发态的最低振动能 级，此过称为。 发生条件：在同一电子能级内进行 时间为：10-12s
振动弛豫：非辐射跃迁形式，在溶液中， 激发态分子通过与溶剂分子的碰撞而将 部分振动能量传递给溶剂分子，其电子 则返回到同一电子激发态的最低振动能 级，此过称为~ 。 发生条件：在同一电子能级内进行 时间为：10-12 s
内部能量转换（内部猝灭）当两个电子激发态之 间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时， 受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁方式转 移至低电子能级。 内转换发生在不同能阶，没有同阶转换。 荧光发射：分子通过内转换及振动弛豫，返回到 第一激发态的最低振动能级，然后再以辐射形 式发射光量子而返回到基态的任意振动能级上， 此时发射的光量子为荧光。 发射荧光的波长比激发光的波长要长
内部能量转换（内部猝灭）当两个电子激发态之 间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时， 受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁方式转 移至低电子能级。 内转换发生在不同能阶，没有同阶转换。 荧光发射：分子通过内转换及振动弛豫，返回到 第一激发态的最低振动能级，然后再以辐射形 式发射光量子而返回到基态的任意振动能级上， 此时发射的光量子为荧光。 发射荧光的波长比激发光的波长要长